表皮細胞生長因子對角質形成細胞體外增殖作用的研究

楊曉波 王思斯 卿欽 王沼丹 楊云霞△

(1.四川省雙流縣中醫(yī)醫(yī)院藥劑科,四川 成都 610200;2.四川大學華西醫(yī)學中心,四川 成都 610044)

細胞增殖、分化、成熟的調控依賴多種活性蛋白質及多肽,統(tǒng)稱為生長因子。目前已發(fā)現(xiàn)包括表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)在內(nèi)的多種生長因子。重組人表皮生長因子(recombinant human EGF,rhEGF)是通過人工合成的表皮生長因子基因片段在大腸桿菌表達系統(tǒng)進行有效表達而獲得的可促進多類細胞生長的多肽類物質,其活性和結構與天然產(chǎn)物高度一致[1]。具有廣泛的促進細胞增殖和組織再生的生物學活性,對體表創(chuàng)傷、燒傷和潰瘍等創(chuàng)面的治療具有較大的臨床應用價值。臨床手術無菌切口情況下,由于沒有感染存在,rhEGF對創(chuàng)面是否像其他創(chuàng)面一樣有效,在臨床應用方面尚有一定的爭議。rhEGF對人角質形成細胞的細胞周期尚未見報道,本文就rhEGF對人角質形成細胞的增殖作用及其細胞周期進行分析研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 角質形成細胞,由小兒包皮環(huán)切術后標本制得。實驗時將細胞懸液按一定細胞密度接種于培養(yǎng)皿中,置37℃,5%CO2孵箱中;2-3d換液一次;當細胞長滿瓶皿70-80%時,根據(jù)需要傳代或凍存細胞。

1.1.2 試劑 rhEGF,經(jīng)細菌發(fā)酵獲得,凍干粉保存,臨用時用生理鹽水配制成所需濃度。DMEM、PRMI-1640培養(yǎng)基(Gibco),小牛血清、胎牛血清(成都哈里生物工程有限公司);3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(M TT)(Sigma)。金因肽(JYT)：無色透明液體,規(guī)格：15ml?支-1,2000IU?ml-1,批號：20030904;(深圳市華生元基因工程發(fā)展有限公司)。

1.1.3 儀器 SANYO CO2培養(yǎng)箱(SANYO Labo Autoclave);超凈工作臺(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司);Epics-XLII型流式細胞儀(美國);31007R型液體閃爍計數(shù)器(美國)。

1.2 方法

1.2.1 MTT法測定細胞的增殖 取對數(shù)生長期細胞1.5×105接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi),每孔 100μ l,設 6個復孔。加 rhEGF使?jié)舛葹?,5,10,20,50,100 ng?ml-1及調零孔加100μ l培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)48h,結束前4h,加 10μ l M TT,常規(guī)終止實驗,與DG3022A型酶聯(lián)免疫檢測儀上測各孔吸光值,波長490nm。按下列公式計算相對增殖率(Relative growth rate,RGR)：RGR=給藥孔吸光度值/對照孔吸光度值×100%。

1.2.2 不同作用時間對細胞增殖的影響 取對數(shù)生長期細胞1.5×105接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi),每孔100μ l,設6個復孔。分別在不同時間(6,12,24,48,72h)加濃度為10 ng?ml-1rhEGF培養(yǎng),結束前4h,加10μ l MTT,常規(guī)終止實驗,按照2.1的方法測定吸光值并計算相對增殖率。

1.2.33HtdR摻入法測細胞生長率 以每孔2×105個細胞的濃度加入六孔板中,設4個復孔。待細胞貼壁后加入不同濃度的rhEGF作用與細胞48h,然后加入3HtdR(3H標記的胸腺嘧啶核苷)(終濃度為0.5μ Ci?ml-1)。6h后收集細胞,紙片法在液體閃爍計數(shù)儀測定細胞的液體閃爍計數(shù)(cpm)值。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞周期 接種2×105個細胞于75ml培養(yǎng)瓶中,待細胞貼壁后加入不同濃度的rhEGF作用于細胞48h,收集細胞,流式細胞儀激發(fā)光源為15mW 氬離子激光器,激發(fā)波長488mm,應用Expo 32 ADC進行免疫熒光數(shù)據(jù)分析,用Muticycle AV分析軟件對DNA細胞周期擬合;根據(jù)細胞周期時相,計算細胞的增殖指數(shù)(PI)：PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100% 。

1.3 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)用“均數(shù)±標準差”表示,用SPSS11.5軟件進行統(tǒng)計學分析,組間兩兩比較采用t檢驗及x2檢驗。

2 結果

2.1 MT T法測定細胞的增殖 結果見表1,rhEGF在濃度為5～100 ng?ml-1均可以促進人角質形成細胞的生長,在 10 ng?ml-1時促進細胞的生長的作用最為明顯。

2.2 不同作用時間對細胞增殖的影響 結果見表2,濃度為10 ng?ml-1的rhEGF在各時間點均可以促進人角質形成細胞的生長,作用48h促進細胞的生長的作用最為明顯。

表1 重組人表皮細胞生長因子對表皮細胞吸光值及增殖率的影響±s,n=6)

組別(ng?ml-1) 光密度 相對增殖率(%)對照組 0.69±0.020 rhEGF 5 0.93±0.019 134.7810 0.99±0.010 143.4820 0.95±0.018 137.6850 0.92±0.013 133.33100 0.91±0.011 131.88

表2 重組人表皮細胞生長因子作用不同時間對表皮細胞吸光值及增殖率的影響(,n=6)

表2 重組人表皮細胞生長因子作用不同時間對表皮細胞吸光值及增殖率的影響(,n=6)

組別 光密度 相對增殖率(%)對照組 0.69±0.020作用時間(小時) 6 0.91±0.017 131.8812 0.92±0.014 133.3324 0.94±0.021 136.2348 0.99±0.010 143.4872 0.92±0.013 133.33

2.33HtdR摻入法測細胞生長率 不同濃度的rhEGF作用與細胞48h,用3HtdR摻入法測定細胞生長,結果發(fā)現(xiàn)rhEGF在濃度為5～50 ng?ml-1均可以促進角質形成細胞的生長,在10 ng?ml-1時促進細胞的生長的作用最為明顯,經(jīng)t檢驗各濃度rhEGF與對照組相比有明顯差異(P＜0.01)(表3)。

表3 重組人表皮細胞生長因子促進角質形成細胞生長的cpm值(,n=4)

表3 重組人表皮細胞生長因子促進角質形成細胞生長的cpm值(,n=4)

與對照組相比：△△P＜0.01

組別(ng?ml-1) Cpm值對照組 875.67±332.85 rhEGF 5 2541.67±38.40△△10 3304.33±134.24△△50 2982.33±88.56△△

2.4 流式細胞儀檢測細胞周期 rhEGF處理組的細胞在DNA合成前期減少,而處于DNA合成期的細胞相對增加,S和G2/M期細胞數(shù)增加,G0/G1細胞數(shù)減少,增殖率較未用rhEGF組明顯增高,相比具有統(tǒng)計學差異。表明重組人表皮細胞生長因子可以促進角質形成細胞的分裂增殖,結果見表4。

表4 重組人表皮細胞生長因子對角質形成細胞周期的影響以及增殖指數(shù)的變化(,n=6)

表4 重組人表皮細胞生長因子對角質形成細胞周期的影響以及增殖指數(shù)的變化(,n=6)

與對照組相比：△P＜0.05,△△P＜0.01,△△△P＜0.001

組別(ng?ml-1) G0/G1期(%) S期(%)G2/M期(%) 增殖指數(shù)rhEGF 0 53.9 29.4 16.7 46.15 39.3 41.3 19.4 60.7△10 31△ 39.9 29.1 69△△△50 35.8△ 42.3 21.9 64.2△△

3 討論

表皮生長因子(EGF)是廣泛存在于人體多種組織的一種多肽因子,具有刺激上皮細胞增生,加快創(chuàng)傷愈合的作用[1]。創(chuàng)面愈合能力除與創(chuàng)面產(chǎn)生原因有關外,還與創(chuàng)面修復內(nèi)環(huán)境的改變、內(nèi)源性生長因子含量或受體活性等因素有關。EGF與其受體結合可激活直接調控或誘導細胞增殖的調節(jié)生長基因,參與體表創(chuàng)傷的愈合過程。在創(chuàng)傷修復過程中,由于組織中的EGF含量普遍較低,難以滿足細胞增殖和肉芽組織發(fā)育的需要,因此,理論上外源性的EGF可加速創(chuàng)面的愈合速度[2]。

目前,重組人表皮生長因子已成為多種創(chuàng)傷的治療藥物,如在燒傷及各種慢性創(chuàng)面、消化系統(tǒng)潰瘍、口腔潰瘍、角膜潰瘍的治療中取得了一定進展。臨床手術無菌切口情況下,由于沒有感染存在,愈合比感染傷口為快,rhEGF對創(chuàng)面是否像其他創(chuàng)面一樣有效,在外科手術后切口應用的實際價值方面尚有一定的爭議。有研究顯示,在小兒腭裂修復時使用基因重組人表皮生長因子,能有效地促進和加快切口愈合[3]。為此我們從小兒包皮環(huán)切術后皮膚標本制得角質形成細胞,觀察 rhEGF對其是否具有增殖作用,結果顯示,rhEGF對人角質形成細胞具有促增殖作用,而且在10 ng?ml-1時作用最為明顯;MT T法和3HtdR摻入法測細胞生長率結果一致,作用48h促進增殖作用最為明顯。流式細胞術的進一步研究表明rhEGF處理細胞48h后處于DNA合成期的細胞增加,細胞增殖率分別較陰性對照組增加,表明rhEGF促進細胞增殖與加快細胞周期有關,可促使更多的細胞進入分裂期。以往的動物研究顯示rhEGF可以促進創(chuàng)傷愈合[4-5]。

EGF的量效關系有不同的報道,一般認為在適當濃度時可有效刺激表皮細胞的增殖,過高濃度的rhEGF并不促進細胞的增殖,生物學效應反而降低,其機制可能是rhEGF受體活性的下調[6]。本實驗結果表明rhEGF小、中、大劑量之間未見明顯的量效關系,在所選的劑量范圍內(nèi)均能有效地促進表皮細胞增殖,促進創(chuàng)傷的愈合,但小劑量就能夠達到有效的治療目的。

1 Jahovic N,Guzel E,Arbak S,et al.The healing-promoting effect of saliva on skin burn is mediated by epidermal growth factor(EGF)：role of the neutrophils[J].Burns,2004,30(6)：531-538.

2 Hardwicke J,Ferguson EL,M oseley R,et al.Dextrin-rhEGF conjugates as bioresponsive nanomedicines for wound repair[J].J Control Release,2008,130(3)：275-283.

3 王懷谷,汪春蘭,李光早,等.基因重組人表皮生長因子在腭裂修復術中的應用[J].蚌埠醫(yī)學院學報,2008,33(1)：41-42.

4 郝杰,彭波,楊云霞,等.重組人表皮生長因子加速皮膚創(chuàng)傷修復的實驗研究[J].四川生理科學雜志,2006,28(4)：156-158.

5 繆世坤,彭波,楊云霞,等.重組人表皮生長因子對大鼠皮膚燒傷愈合的促進作用[J].四川生理科學雜志,2007,29(3)：107-108.

6 Duconge J,Prats PA,Valenzuela C,et al.Topical disposition of two strengths of a 125I-rhEGF jelly in rat skin wounds[J].Biopharm Drug Dispos.,2004,25(5)：193-201.