解磷根瘤菌液體培養基類型，濃度及透氣條件的比較

李劍峰，張淑卿，師尚禮，霍平慧

(1.甘肅農業大學草業學院，草業生態系統教育部重點實驗室，中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅蘭州 730070)

磷是植物生長發育不可或缺的重要元素，我國大部分區域土壤平均含磷量0.12%，但其在土壤溶液中的濃度一般僅有0.005～1.0 mg/kg，總量充足而可溶性磷含量匱乏，難以供植物直接吸收利用[1]，而施入土壤的化學磷肥利用率很低，通常只有5%～25%[2]。而解磷微生物產生的植酸酶，核酸酶和磷酸酶等加速了植酸、核酸、磷脂等含磷有機化合物的分解，這些有機酸可與無機磷進行螯合[3]，使土壤中的難溶性無機磷向可溶性磷轉化[4]，是改善植物磷素營養，增加土壤中的可溶性磷[5，6]的重要途徑。目前，對微生物參與難溶態磷素利用的研究多局限在芽孢桿菌(Bacillus megaterium)[7]和真菌、放線菌等方面，而對涉及解磷根瘤菌菌種培養和發酵的研究報道較少。祁娟等[8]在苜蓿種子中分離得到一株根瘤菌SL01，具備溶解難溶性無機磷的能力，有較好的利用價值和開發潛力，但解磷根瘤菌同其他微生物一樣對特定的培養環境有特定的要求，不同的培養基類型和濃度下，菌種的發酵速度有很大的差異[9]，并且在根瘤菌制劑的不同工藝流程中，對菌株生長速度，發酵培養液的營養容量都有不同的要求。因此，研究擬通過對SL01菌株在不同類型和濃度培養基下的發酵速度和培養基的pH值變化進行比較和分析，以期得到適于SL01菌株液體發酵的種子培養基及發酵培養基。為解磷根瘤菌培養條件的研究及解磷根瘤菌制劑的生產提供參考和依據。

1 材料和方法

1.1 供試菌株及培養基

供試菌株為解磷苜蓿根瘤菌SL01，由甘肅農業大學草業生態系統重點試驗室提供。

YMA培養基參考文獻[10]的方法配制，KH2PO4 0.5 g ，酵母粉 1.0 g，甘露醇 10.0 g ，MgSO4.7H2O 0.2 g，NaCl 0.1 g，pH 值6.8～ 7.2，蒸餾水 1 000 mL 。YMA剛果紅固體培養基[11]每升加10 mL 0.25%的剛果紅溶液和15.0克瓊脂。

牛肉膏蛋白胨培養基[12]:牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g ，水 1 000 mL ，pH 7.2。

LB培養基參考[12]:酵母膏 5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl10.0 g，蒸餾水 1 000 mL ，pH 值 7.0～7.2

按以上3種培養基配方分別配制含其完全培養基百分數為100%，50%和25%，共計6個類型的液體培養基。

儀器和設備采用英國Jenway公司生產的3305型pH計；WPA S2000型紫外/可見光分光光度計，T HC-C自動控溫調速振蕩生化培養箱

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基類型及濃度的篩選 將4℃下YMA斜面保存的SL01菌種連同試管斜面在28℃下活化24 h，將活化菌種接一環到裝有50 mL液體培養基的250 mL三角瓶中，28℃，120 r/min避光培養，培養期間每2 h以分光光度計測定菌液OD600nm吸光度值，連續測定30 h。同時以pH計測定菌液pH值，每處理3次重復。

菌體含量的測定:參照唐勇等[13]及梁錦峰等[15]的方法在OD600nm測定菌液的吸光度值，以濁度法用600 nm的OD值表示發酵液的菌體含量。

1.2.2 透氣條件的比較 在選擇出適宜的發酵培養基后，在裝有50 mL YMA液體培養基的150 mL三角瓶中接入菌株，以膠塞密封瓶口作為密閉培養處理，并以透氣封口膜封裝瓶口的處理作為透氣培養。所有處理在28℃下120 r/min振蕩培養，每處理4次重復。培養24 h后分別取各處理稀釋1×104、1×106和1×108倍的菌液0.2 mL，均勻涂抹在9 cm直徑的YMA剛果紅固體平板上，28℃培養24 h，以稀釋平板法測算每毫升菌液中的活菌含量，并選取單菌落數在30～300的固體平板，測定單菌落的直徑。每處理6次重復。

1.3 數據分析

采用Excel軟件進行數據整理，用DPS 3.0軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 根瘤菌培養基類型和濃度的選擇

測定了SL01菌株在供試的3個類型共9種液體培養基中生長的OD值，并繪制曲線(圖1)。菌株在LB和1/2 LB液體培養基中最先進入快速生長期，并將快速生長期分別維持到第28 h和26 h，說明菌株在這兩種培養基中生長的速率顯著高于在YMA和牛肉膏蛋白胨培養基中的生長速率(P＜0.05)，且30 h內的菌液OD值均顯著高于其他液體培養基。但1/4濃度的LB培養基在14 h后營養基本消耗殆盡，菌液OD值不再變化。YMA完全培養基中，發酵菌液的OD值增高速率較LB培養基稍低，但對數期生長期較LB培養基更長，穩定期出現的較遲。1/2 YMA和1/4 YMA培養基中，菌液的OD值分別在22 h和26 h時趨于停滯，而YMA完全培養基發酵液的OD值則在30 h內始終增長。SL01菌株在牛肉膏蛋白胨培養基中生長最差，并很快達到穩定期和衰老期。

圖1 不同液體培養基中的SL01菌株發酵液的菌體含量Fig.1 Rhizobia densities of SL01 strain in different liquid culture mediums

2.2 不同類型培養基SL01發酵菌液的pH值變化

通過測量發酵過程中的培養基酸度發現，所有培養液在最初6 h，pH值均隨菌密度的增大而降低，表明SL01菌株在開始快速繁殖時產生了大量酸性物質，在6～12 h，YMA培養基發酵液持續變酸，LB培養基，1/2和1/4牛肉膏蛋白胨培養基發酵液的pH值卻不斷升高(圖2)。菌株在對數期代謝旺盛，能夠利用碳源和氮源產生大量的有機酸，在碳氮源均充足的條件下，隨著菌體密度的增大，發酵液的pH值持續降低。當碳源不足時，部分菌體發生自溶現象，釋放出胞內氨態氮等堿性物質，使得pH值上升[13]。故此，發酵液pH值的升高說明菌液中發生自溶的菌體數目增多，菌株的產酸代謝變緩。解磷根瘤菌分泌的大量有機酸使SL01菌株具備了溶解難溶性無機磷的特性。供試液體培養基中，YMA、1/2 YMA、1/4 YMA和牛肉膏蛋白胨培養基的碳源較為充足，使其發酵液的pH值始終降低。1/2、1/4的牛肉膏蛋白胨培養基則明顯碳源不足，在發酵6 h后，菌液的OD值雖持續上升，但pH值明顯上升。可見，發酵液中pH值的增高不利于菌株的生長和解磷。

充足的碳源不僅是解磷根瘤菌生長繁殖的必要條件，也促進了菌株的解磷能力。將SL01菌株接種于含過量難溶性無機磷(磷酸鈣)和不同碳源含量的無磷液體培養基中，培養一定時間后，通過測定發酵菌液中的可溶性磷含量可以發現，充足的碳源能使SL01菌株的解無機磷能力發揮到最高水平，而在碳源不充足時，SL01菌株的解磷能力明顯減弱。

圖2 不同培養基發酵菌液的pH值變化Fig.2 pH value change of fermentation broth in different culture mediums

表1 培養透氣對發酵菌液活菌含量和菌株單菌落直徑的影響Table 1 Effects of ventilation condition on live rhizobia content and clone diameter of strains in fermentation

2.3 透氣條件對發酵液內有效菌含量及菌種單菌落直徑的影響

通過比較不同透氣培養條件下SL01菌株發酵液的活菌量和菌株生長活性發現，透氣培養24 h菌液中根瘤菌的活菌數目為密閉培養下的10.51倍，差異顯著(P＜0.05)。透氣條件下培養得到的菌種在YMA固體平板上的單菌落直徑也顯著大于密閉培養得到的菌種，說明發酵中的透氣條件對于SL01菌株的繁殖速度和菌株單菌落生長速度有較大影響。

3 結論與討論

(1)LB和1/2 LB培養基適宜用于溶磷根瘤菌SL01的快速發酵，在有限體積的菌液中能存活高密度的菌體，因此，適合于進行SL01菌株的快速發酵繁殖，用于種子培養基能有效的提高生產效率。但同時也由于菌株繁殖過快，LB培養基中的營養會在短時間內耗盡，使得菌體大量死亡，故不宜用于長期保存大量的菌種。YMA液體培養基由于能使發酵過程保持較長的快速生長期，菌株處于高增殖活力階段的時間較長，故可用于保存大量的活菌，這一結論與尚軍紅等[14]的研究結果一致。

SL01菌株在3種類型不同濃度的液體培養基內的生長速率差異較大，但快速生長期階段菌體的密度均與培養基的濃度間呈正相關，說明液體發酵培養中，菌株的繁殖速度不僅與培養基的類型有關，更受到營養條件的限制。

(2)不同類型的培養基接入解磷根瘤菌SL01并充分發酵之后，發酵液的pH值都相當程度的偏離了初始的酸堿度，這與梁錦峰[15]的研究結果不同，即溶磷菌培養物的終點pH值與初始pH值無明顯的變化。這可能除了菌株本身原因外，合適的碳氮比也是一個非常重要的因素。碳氮比高的培養基經培養后pH值常會明顯下降，而碳氮比低的培養基經培養后其pH則會明顯上升[16]。Wenzelet[17]的研究表明，溶磷桿菌只有在培養基的pH下降到4左右時具有強烈的溶磷活力，而當培養基pH升高時則失去溶磷活性。以上結論表明，要使SL01菌株表現出較強的溶磷能力，充足的碳源是不可或缺的。其具體的變化過程仍有待進一步的研究。此外，根瘤菌作為好氣菌，發酵培養的透氣條件對菌株的增殖能力及菌種的活性密切相關，在解磷根瘤菌的發酵培養中，透氣狀況應作為重要的環節進行考慮。

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