產(chǎn)磷脂酶 C芽孢桿菌 Z-13產(chǎn)酶條件優(yōu)化

詹逸舒,孫天瑋,陳 里,劉仁萍,吳永堯

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,長沙 410128

磷脂酶 C(phospholipase C,PLC)是一類可催化磷酯 C3上的磷酯酰鍵的脂類水解酶,在細胞代謝、信息傳遞和抗血小板功能等方面起著重要作用[1]。其作用底物為甘油磷脂和磷脂酰類,能特異性的水解質(zhì)膜表面鞘磷脂(sphingomyelin,SM)的磷酸二酯鍵產(chǎn)生神經(jīng)酰胺[2,3](ceramide)。神經(jīng)酰胺作為生物信息傳遞的“第二信使”,具有調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞生長,誘導(dǎo)癌細胞程序性凋亡,以及對皮膚的特殊生物高效保濕功能[4]。國外已將其作為重要生理活性成分及醫(yī)藥原料,廣泛應(yīng)用于在藥品、化妝品、美容食品等領(lǐng)域[5]。

目前國外主要從動植物原料中提取神經(jīng)酰胺,植物源比動物源神經(jīng)酰胺更為安全。神經(jīng)酰胺在生物材料中含量非常低(萬分之一至十萬分之一),價格十分昂貴。我國魔芋(Konjac)資源十分豐富,占世界魔芋種數(shù)的 22.6%。其中含有豐富的神經(jīng)酰胺(0.15% ～0.2%),是米糠和小麥中(0.01% ～0.02%)的 10倍[6],但其中的神經(jīng)酰胺與磷酸膽堿結(jié)合以鞘磷脂形式存在于細胞膜中,而呈結(jié)合狀態(tài)的神經(jīng)酰胺難以直接提取。為使可提取的游離神經(jīng)酰胺含量提高,積極開發(fā)產(chǎn)生特殊活性的 PLC的菌株,具有十分重要的意義。作者對產(chǎn)磷脂酶 C芽孢桿菌 Z-13產(chǎn)酶條件進行了研究,目的在于優(yōu)化產(chǎn)酶條件,提高產(chǎn)酶能力,為磷酯酶 C的開發(fā)利用及魔芋神經(jīng)酰胺的提取打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養(yǎng)基

產(chǎn)磷脂酶 C芽孢桿菌 Z-13由本實驗室分離、篩選并保藏。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基:蛋白胨 1.0%、牛肉膏 0.3%、NaCl 0.5%、pH 7.2～7.4,1×105 Pa滅菌 30min。

硼砂卵黃培養(yǎng)基:硼砂 0.19% 、硼酸 1.09%、NaCl 0.66% 、卵黃 10%,pH 7.2～7.4。

1.2 產(chǎn)磷脂酶 C菌 Z-13產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

1.2.1 培養(yǎng)基組成的確定

保持基礎(chǔ)培養(yǎng)基其它組成不變,依次改變培養(yǎng)基的氮源、碳源和無機鹽種類,等量接種 Z-13菌懸液,35℃、裝液量為 100mL/250m L、150 r/min搖床培養(yǎng) 12 h,測定發(fā)酵液中磷脂酶 C活性及生物量。

確定最佳氮源、碳源和無機鹽后,采用均勻設(shè)計試驗[7],利用 DPS v7.05專業(yè)版軟件的均勻試驗設(shè)計表,根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果及試驗可行性確定考察因素的范圍,對篩選出的培養(yǎng)基組分進行優(yōu)化,然后通過二次多項式逐步回歸分析實驗數(shù)據(jù),建立回歸方程,通過指標(biāo)最大預(yù)測值確定發(fā)酵培養(yǎng)基各組分的適合配比,并進行驗證試驗。

1.2.2 產(chǎn)酶培養(yǎng)條件的確定

采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基,分別從接種量、搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)基初始 pH值、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間等進行單因素試驗。

1.3 粗酶液制備

培養(yǎng) 12 h的發(fā)酵液用 60目紗布粗濾,8000 r/min離心 25min,收集上清液即為粗酶液,供酶活測定。

1.4 生物量測定

平板菌落計數(shù)法

1.5 酶活測定

卵黃瓊脂杯碟法[8,9]:取 20 g卵黃(新鮮的土雞蛋),加 80mL無菌水,搖勻,得到 20%的卵黃液,再制成硼砂卵黃瓊脂培養(yǎng)基。待培養(yǎng)基溶化后,倒入培養(yǎng)皿中冷卻凝固,其上平放牛津杯,吸取 100μL粗酶液于杯中,37℃條件下培養(yǎng) 24 h,根據(jù)磷脂酶C能水解卵黃瓊脂平板中卵磷脂產(chǎn)生乳白色的暈圈,用游標(biāo)卡尺測定反應(yīng)后生成的乳白色暈圈(沉淀圈)直徑,乳白色暈圈越大,PLC活性越大。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素法優(yōu)化培養(yǎng)基組成

2.1.1 碳源

基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加濃度為 1.0%的不同碳源,它們對磷脂酶 C活力及生物量影響見表 1。從表中可以看出,可溶性淀粉和魔芋飛粉為碳源時菌Z-13產(chǎn)酶能力明顯優(yōu)于牛肉膏、葡萄糖、蔗糖、麩皮、玉米粉,說明菌 Z-13利用可溶性淀粉和魔芋飛粉的能力優(yōu)于其他幾種碳源。其中魔芋飛粉作為碳源時,對其產(chǎn)酶影響較大,乳白色沉淀圈直徑達到了23mm,生物量為 4.5×107CFU/mL,這可能是由于魔芋飛粉中含有的豐富淀粉和鞘磷脂化合物,及其它有利于其生長的營養(yǎng)成分,促進了其發(fā)酵產(chǎn)酶,因此選擇魔芋飛粉為碳源。

表 1 不同碳源對酶活和生物量的影響Table 1 Effect of different carbon sources on enzyme activity and biomass

2.1.2 氮源

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加濃度為 1.5%的不同氮源,它們對磷脂酶 C活力及生物量的影響見表 2。從圖中可以看出,酵母膏作氮源時發(fā)酵后產(chǎn)磷脂酶C活性最高,乳白色沉淀圈直徑達到了 24mm。這說明菌 Z-13利用酵母膏的能力優(yōu)于其他幾種氮源。這可能與酵母粉含有的氨基酸、維生素等生長因子的配比更適合其的生長。其中黃豆粉作氮源時,乳白色沉淀圈直徑達到了 22mm,略低于酵母膏,但明顯高于其他 2種無機氮源,且生物量為 1.6×108CFU/mL,高于其他氮源。由于黃豆粉是發(fā)酵工業(yè)最常用的有機氮源,價格便宜,而且其中含有的豐富磷脂類化合物能誘導(dǎo)該菌種產(chǎn)酶,綜合考慮效果與原料成本,因此選擇黃豆粉為氮素營養(yǎng)。

表 2 不同氮源對酶活和生物量的影響Table 2 Effect of different nitrogen sources on enzyme activity and biomass

2.1.3 無機鹽

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加濃度為 0.2%的不同無機鹽,它們對磷脂酶 C活力及生物量的影響見表3。結(jié)果表明,Zn2SO4?7H2O和 K2HPO4?3H2O有利于菌種生長,對產(chǎn)酶有一定的促進作用,產(chǎn)生的乳白色沉淀圈直徑大于其他無機鹽,生物量也高于其他無機鹽。可能由于金屬離子中 Zn2+是酶的輔酶或激活劑[10];同時磷是氧化磷酸化反應(yīng)的必需元素,K+能影響細胞膜的通透性,磷酸鹽既能促進菌體的基礎(chǔ)代謝,又影響許多代謝產(chǎn)物的生物合成,因此選用 Zn2SO4?7H2O和 K2HPO4?3H2O為無機鹽組合,添加到培養(yǎng)基中進行下一步優(yōu)化試驗。

表3 不同無機鹽對酶活和生物量的影響Table 3 Effect of different inorganic salts on enzyme activity and biomass

2.2 均勻設(shè)計法優(yōu)化培養(yǎng)基

培養(yǎng)基中各組分之間有一定的內(nèi)在聯(lián)系,在單因素試驗的基礎(chǔ)上,考察培養(yǎng)基中碳源、氮源及無機鹽的含量對菌種生長及產(chǎn)磷脂酶 C的影響,以尋求培養(yǎng)基中各組分的最佳配比。對篩選出的 4種培養(yǎng)基組分進行了優(yōu)化,采用 4因素 15水平 15組試驗的方式,每 1 L培養(yǎng)基內(nèi)各因素水平為:魔芋飛粉和黃豆粉 0.0～35 g,各水平差為 2.5 g;K2HPO4?3H2O和 ZnSO4?7H2O 0.0～2.8 g,各水平差為 0.2 g。均勻設(shè)計表及試驗結(jié)果見表 4。

表 4 均勻設(shè)計試驗優(yōu)化培養(yǎng)基方案和結(jié)果Table 4 The scheme and resultofmedium optimization by uniform design

采用 DPS v7.05專業(yè)版軟件,將表 4中各因素各水平對酶活的影響結(jié)果,進行二次多項式逐步回歸分析,最終得到如下方程:

y=13.06-2.59X1+3.92X2+23.03X3+21.42X4+0.39X21-0.50X22-4.52X23-84.94X2

4

相關(guān)系數(shù) R=0.9282,檢驗值 F=4.6703,顯著水平 p=0.0382,剩余標(biāo)準(zhǔn)差 S=2.0874,調(diào)整后的相關(guān)系數(shù) Ra=0.8229查表 F0.05(4,10)=3.48,F＞F0.05(4,10),顯著性水平檢驗通過,回歸方程顯著。

根據(jù)回歸方程對 y求最大值,當(dāng) x1=2.5 g/L,x2=30 g/L,x3=2.8 g/L,x4=1.3 g/L時,Ymax=27.75 mm,其預(yù)測區(qū)間為:Y=Ymax±Uα? S=27.75 ±4.09。

即以魔芋飛粉 2.5 g/L、黃豆粉 30 g/L、K2HPO4? 3H2O 2.8 g/L、Zn2SO4? 7H2O 1.3 g/L為優(yōu)化培養(yǎng)基配方時,通過卵黃瓊脂杯碟法測得產(chǎn)生的乳白色暈圈(沉淀圈)直徑應(yīng)該在 23.66～31.84 mm范圍內(nèi)。根據(jù)優(yōu)化條件,取魔芋飛粉 2.5 g/L、黃豆粉30 g/L、K2HPO4? 3H2O 2.8 g/L、Zn2SO4? 7H2O 1.3 g/L,進行 3次搖瓶實驗驗證,最終乳白色暈圈(沉淀圈)直徑的平均結(jié)果為 27mm,生物量為 5.7×108CFU/m L,實驗結(jié)果在預(yù)測的范圍內(nèi),且均有顯著性提高。

2.3 產(chǎn)酶條件確定

2.3.1 接種量優(yōu)化

在相同培養(yǎng)條件前提下,分別按 0.1%、0.5%、1%、4%和 8%的接種量接種菌懸液(菌濃度 3×105 CFU/mL)于培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),它們對磷脂酶 C活力及生物量的影響見圖 1。結(jié)果表明,接種量為0.5%時,暈圈直徑為 26 mm,是 5個不同梯度接種量中暈圈最大的;接種量為 1.0%時生物量達到最大,暈圈直徑為 24.5mm,酶活下降不大。當(dāng)接種量逐漸繼續(xù)增大時,酶活反而減小,這可能是由于隨接種量的增加,菌體繁殖過快、過稠,造成營養(yǎng)基質(zhì)缺乏或溶氧不足而不利于菌體產(chǎn) PLC。基于磷脂酶 C活力及生物量綜合考慮,選擇接種量為 1.0%的為該菌培養(yǎng)的合適接種量。

圖1 接種量對酶活和生物量的影響Fig.1 Effects of inoculation size on enzymeactivity and biomass

2.3.2 轉(zhuǎn)速優(yōu)化

分別在搖床轉(zhuǎn)速為 60 r/min、100 r/min、150 r/min和 200 r/min的條件下進行搖瓶培養(yǎng),搖床轉(zhuǎn)速與酶活及生物量的關(guān)系見圖 2。結(jié)果表明,在較低的轉(zhuǎn)速下,溶解氧濃度較低,所得到的生物量較小,發(fā)酵液的酶活力較低;轉(zhuǎn)速為 150 r/min時,乳白色暈圈直徑最大,且生物量也達到最大;搖床轉(zhuǎn)速在200～250 r/min之間,由于轉(zhuǎn)速過快,剪切力過大,不利于菌種生長,發(fā)酵產(chǎn) PLC能力略有下降。基于提高溶氧,菌種的耐受力及節(jié)約能源方面的考慮,選擇搖床轉(zhuǎn)速150 r/min為該菌培養(yǎng)的合適搖床轉(zhuǎn)速。

圖 2 搖床轉(zhuǎn)速對酶活和生物量的影響Fig.2 Effects of rotating speed on enzyme activity and biomass

2.3.3 溫度優(yōu)化

圖3 溫度對酶活和生物量的影響Fig.3 Effects of temperature on enzyme activity and biomass

溫度可通過影響發(fā)酵過程中酶反應(yīng)速率、蛋白質(zhì)性質(zhì)及發(fā)酵液物理性質(zhì),進而影響發(fā)酵的動力學(xué)特性和產(chǎn)物的合成。分別按 25、28、32、35、40℃搖瓶培養(yǎng),培養(yǎng)溫度與酶活及生物量的關(guān)系見圖 3。結(jié)果表明,在 25～36℃的溫度范圍內(nèi),菌體生物量隨溫度增加而不斷增加,同時酶活力也在 32℃左右達到最大;當(dāng)溫度繼續(xù)升高,不利于菌 Z-13生長和PLC積累,生物量及酶活力均呈下降趨勢。因此,選擇溫度為 32℃為該菌合適的培養(yǎng)溫度。

圖 4 pH對酶活和生物量的影響Fig.4 Effects of pH on enzyme activity and biomass

2.3.4 初始 pH優(yōu)化

分別按培養(yǎng)基初始 pH 5、6、7、8、9、10和 11搖瓶培養(yǎng),培養(yǎng)基初始 pH與生物量及酶活的關(guān)系見圖 4。結(jié)果表明,當(dāng)培養(yǎng)基初始 pH小于 10時,酶活隨 pH提高而增大,菌體生物量在 pH值為 8時達到最大,且 pH在 8～10范圍內(nèi),生物量變化不大;當(dāng)pH值為 11時,酶活開始顯著下降,菌體生物量與產(chǎn)PLC酶活的培養(yǎng)基合適初始 pH都在堿性范圍內(nèi)。基于菌種生長和 PLC的積累方面的考慮,選擇pH9.0為該菌發(fā)酵合適的初始培養(yǎng)基 pH。

2.3.5 培養(yǎng)時間優(yōu)化

圖 5 培養(yǎng)時間對酶活和生物量的影響Fig.5 Effects of time on enzyme activity and biomass

微生物發(fā)酵終點的判斷,對提高產(chǎn)物的生產(chǎn)能力和經(jīng)濟效益很重要的,因此確定一個合適的培養(yǎng)時間十分必要,培養(yǎng)時間與生物量及酶活的關(guān)系見圖 5。結(jié)果表明,隨著培養(yǎng)時間的延長,菌體的生長繁殖,酶活開始有明顯的上升,培養(yǎng) 15 h后,酶活達到最大值,18～21 h菌體達到對數(shù)生長期。隨著時間的推移,營養(yǎng)物質(zhì)不斷減少,組成成分發(fā)生變化,菌體的生長繁殖速度下降;同時由于菌體釋放體內(nèi)的分解酶及各種環(huán)境因子的改變抑制了酶的活性。因此,發(fā)酵培養(yǎng)時間不宜過長,最佳培養(yǎng)時間為15 h。

2.3.6 產(chǎn)酶條件優(yōu)化前后 PLC酶活定性測定

利用磷脂酶 C可水解卵黃中的卵磷脂,在含有卵黃的瓊脂平板上產(chǎn)生乳白色暈圈的特點(如圖 6所示),可以根據(jù)酶樣品在卵黃平板上所產(chǎn)生的乳白色暈圈的大小來定性檢測菌種產(chǎn)磷脂酶 C酶活的高低。由于操作方便,原料豐富,廣泛的應(yīng)用于磷脂酶 C菌種的篩選及磷脂酶 C的純化制備[11,12]。將菌 Z-13接種至產(chǎn)酶優(yōu)化前后培養(yǎng)基中,分別在優(yōu)化前后的條件進行培養(yǎng),卵黃瓊脂杯碟法定性測定PLC酶活,結(jié)果如圖 6所示。結(jié)果表明,在原始條件下,菌 Z-13產(chǎn)磷脂酶 C產(chǎn)生的沉淀圈(乳白色暈圈)直徑為 22 mm,經(jīng)過產(chǎn)酶條件優(yōu)化后,菌 Z-13產(chǎn)磷脂酶 C產(chǎn)生的沉淀圈(乳白色暈圈)直徑為 30 mm,增加了 8mm,產(chǎn)磷脂酶 C活性顯著性提高。

圖 6 卵黃瓊脂杯碟法酶活定性檢測Fig.6 Qualitative detection ofenzyme activity by egg yolk cylinder platemethod

3 小結(jié)

目前國內(nèi)還沒有商業(yè)化的工業(yè)用 PLC制劑生產(chǎn),對于細菌產(chǎn)磷脂酶 C的產(chǎn)酶條件研究研究報道還較少。本文以生物量和酶活為主要指標(biāo),采用單因素優(yōu)化方法結(jié)合均勻設(shè)計試驗,對芽孢桿菌菌 Z-13產(chǎn)磷脂酶 C(phospholipase C,PLC)條件進行了優(yōu)化,確定產(chǎn)酶培養(yǎng)基的適宜碳源為魔芋飛粉、適宜氮源為黃豆粉,適宜無機鹽為磷酸氫二鉀和硫酸鋅,采用均勻優(yōu)化試驗設(shè)計,確定培養(yǎng)基組成為魔芋飛粉2.5 g/L、黃豆粉 30 g/L、K2HPO4? 3H2O 2.8 g/L、Zn2SO4?7H2O 1.3 g/L;在培養(yǎng)條件為接種量為1.0%、搖床轉(zhuǎn)速為 150 r/min、培養(yǎng)溫度 30℃、初始pH值 9.0、培養(yǎng) 15 h,有利于菌 Z-13生長及產(chǎn)磷脂酶 C,活菌總數(shù)為 4.5×109CFU/m L,卵黃瓊脂杯碟法測定磷脂酶 C產(chǎn)生的沉淀圈(乳白色暈圈)直徑可達 30mm左右。本研究所獲得芽孢桿菌 Z-13的優(yōu)化產(chǎn)酶條件,經(jīng)逐級放大試驗,將有可能在解決魔芋鞘磷脂酶法水解產(chǎn)神經(jīng)酰胺過程中提供生物催化劑,使可提取的游離神經(jīng)酰胺含量提高,為磷酯酶 C的工業(yè)生物技術(shù)開發(fā)利用及魔芋神經(jīng)酰胺的生物加工過程打下基礎(chǔ)。

1 Chen T(陳濤),Wang CG(王常高),He DP(何東平).The mutation of high phospholipase C productivity strain.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))2005,17:712-716.

2 Hou LL(侯麗莉),Chen XH(陳肖華).Property and function of acid sphingomyelinase.Int J Radiat Med Nucl Med(國外醫(yī)學(xué):放射醫(yī)學(xué)核醫(yī)學(xué)分冊),2005,25:44-47.

3 Yang D(楊棟),Yang LX(楊麗霞).The role of ceramide in apoptosis.J Int Pathology Clini Med(國際病理科學(xué)與臨床雜志),2006,26:166-168.

4 Kong CZ(孔垂?jié)?,Wang X(王俠).神經(jīng)酰胺對人膀胱癌細胞凋亡誘導(dǎo)作用及其機制.Chin JExp Surgery(中華實驗外科雜志),2006,10:1159-1161.

5 Sun QJ(孫慶杰).Research and development of natural ceram ide.China Oils and fats(中國油脂),2003,2:60-61.

6 Pu YF(蒲云峰),Zhang WM(張偉敏),Zhong G(鐘耕).Application and function of ceramide.JCereals＆Oils(糧食與油脂),2005,7:14-16.

7 Zhen XT(鄭曉婷),Zhao XZ(趙新淮).Optimization of fermentation conditions for proteases p roduced by mucor.Inst Microbiology(微生物學(xué)通報),2009,36:193-197.

8 Schm iel DH,Miller VL.Bacterial phospholipase and pathagensis.Micral Infect,1999,1:1103-1112.

9 Gao L(高林),Chen T(陳濤),Gao ZM(高智謀).Op timal conditions of Bacilus cereus Shenzhen 754-1 strain with high phospholipase C production.JAnhui Agric Univ(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報),2007,34:501-504.

10 Kook-Hwa Seo,Jong Il Rhee.H igh-level expression of recombinantphospholipase C from Bacilluscereusin Pichia pastoris and its characterization.Biotechnology Letter,2004,26:1475-1479.

11 Sun CL(孫春來),Gan X(干信).Studies on the purification of phospholipase C.JHubei Univ Tech(湖北工學(xué)院學(xué)報),2004,19(2):8-10.

12 Wang CG(王常高),Cheng MK(陳明鍇),Cheng T(陳濤).Study on selection of strain with high production phospholipase C and its anti-platelet function.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā)),2003,15:345-348.