高速逆流色譜法分離純化青皮中六種多甲氧基黃酮

于 波 ,彭愛一 ,齊 鑫 ,曲學偉 ,李 慧 ,楊 紅

遼寧師范大學生命科學學院,大連 116029

高速逆流色譜(High-Speed Counter-Current Chromatography,HSCCC)是利用溶質在兩種互不相溶的溶劑系統中分配系數的不同,從而進行分離的色譜方法。由于不使用固體支持介質,避免了因與固體填料發生不可逆吸附造成的樣品損失,使樣品得以全部回收,具有分離容量大、高效、快速的特點,廣泛應用于生物,化學,食品工業等領域。由于該技術具有高承載量,高分離度的特點,適于有效的分離純化傳統中藥當中的活性成分[1-3]。

青皮 (Pericarpium citri Reticulatae Viride),為蕓香科植物橘(Citrus reticulata Blanco)及其栽培變種的干燥幼果或未成熟果實果皮。是《中國藥典》記載的最為常用的傳統中藥植物之一,中醫用煎劑內服治療胸肋脹痛、胃部痞滿、疝氣、食積、乳腫、乳核等癥。青皮中主要含有黃酮、揮發油和少量氨基酸成分,其中黃酮類化合物含量較高。PMFs作為青皮中的抗癌活性成分,對多種癌細胞有較強的抑制作用。最近發現橘皮素具有保護細胞抵抗內質網應激和細胞毒素[4],抑制神經母細胞瘤增殖[5]等作用。本實驗針對青皮中的黃酮類成分,利用 HSCCC從青皮粗提物中分離純化到六種具有生物活性的 PMFs,其化學結構見圖 1。

圖 1 6種多甲氧基黃酮類化合物的化學結構Fig.1 Chemical structures of 6 polymethoxyflavone compounds

1 儀器與材料

TBE-300高速逆流色譜儀(上海同田生化技術有限公司),包括 TBP-50A泵,TBD-23UV紫外檢測器(254 nm),N2000雙通道色譜工作站;waters2695高效液相色譜儀(美國 waters公司),二級管陣列PDA檢測器(型號 waters2996,檢測波長范圍 190 nm～800 nm);Quattro Micro質譜儀 (美國 waters公司);500兆赫超導核磁共振儀(Nuclear Magnetic Resonance,NMR)(AVANCE500 Hz型,瑞士 Bruker公司)。石油醚(60～90℃)、乙酸乙酯、甲醇等均為分析純(天津市科密歐化學試劑有限公司),95%乙醇(盤錦天源藥業有限公司),無水乙醇(北京化工廠),水為自制三蒸水及娃哈哈純凈水;HPLC所用的甲醇、乙腈均為色譜純試劑(Honeywell)、冰乙酸(天津市凱信化學工業有限公司),D101大孔樹脂(天津市大鈞科技開發有限公司)。

藥材購自于吉林省仙草醫藥藥材有限公司,經遼寧中醫藥大學藥學院王冰教授鑒定為青皮(Pericarpium citriReticulatae Viride)。

2 實驗方法

2.1 黃酮的提取和富集

青皮樣品干燥后經粉碎機粉碎,過 100目篩,得到青皮粉末 100 g。提取方法為:加 800mL 95%乙醇,回流提取 2次,每次 6 h。過濾,合并濾液,減壓回收乙醇,得浸膏 24 g。將浸膏用 50倍體積的氯仿 -甲醇-水(2∶1∶1)體系萃取 ,靜置 1 h后分離下相,減壓回收下相,濃縮至浸膏。加適量水混懸后,過裝有 D101大孔吸附樹脂的層析柱(40 cm ×3.0 cm i.d.),靜止吸附 1 h后,依次用水、75%甲醇和95%甲醇洗脫,接收 95%甲醇洗脫物,減壓濃縮至浸膏后真空干燥(60℃),得棕黃色粉末 3.93 g,放入 4℃冰箱保存。

2.2 兩相溶劑體系及樣品溶液的制備

本實驗中 HSCCC溶劑系統為正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水 (4∶6∶4∶6,V/V),按比例將四種溶劑加入分液漏斗中,振蕩使溶液充分混合,室溫下靜置過夜,使用前分得上相(固定相)和下相(流動相),超聲脫氣 30 min以備用。稱取 270 mg青皮粗提物,溶于 18m L下相中,得 15 mg/mL樣品溶液。

2.3 HSCCC的分離制備過程

將已超聲脫氣后的上相(固定相),以 20 mL/min的速度泵入 HSCCC分離管中,待上相充滿整個管路(約 12 min),設定分離管順時針旋轉,緩慢調節主機轉數至 800 r/min,同時以 2 mL/min流速注入下相,兩相達到平衡后由進樣閥注入 18 mL樣品溶液,同時采集數據,通過紫外檢測器(254 nm)檢測流出物,按照色譜峰接收目標餾分。

2.4 HPLC分析條件

色譜柱:XTerra MS C18柱(2.1×150 mm,5 μm)。流動相 A:乙腈,B:0.2%乙酸;梯度程序:0～25min,流動相 A由 10%升至 90%,流速 0.2mL/min;柱溫箱溫度 35℃;檢測波長范圍:200～600 nm。

3 結果與討論

3.1 樣品前處理方法的選擇

由于黃酮類化合物易溶解于甲醇、氯仿、乙酸乙酯等有機溶劑,微溶于水、乙醚,且青皮 95%乙醇提取物中含有親水性黃酮苷以及氨基酸類成分,以 3和 5的含量(面積歸一化法)為例只占總提取物17.07%和 12.61%。若采用有機溶劑逐級萃取方法來處理該樣品,體系的樣品溶解量小,水相體積過大,有機相萃取次數增多。采用氯仿-甲醇-水體系萃取,使粗提物以溶液狀態在上、下相間達到分配平衡:極性成分分布于上相(水相),弱極性成分分布于下相(氯仿相)。在此基礎上通過大孔樹脂梯度洗脫,收集 95%甲醇洗脫液,經 HPLC測定二者含量提升至 35.96%和 34.06%(圖 3)。因此該方法具有萃取體系小,分配時間短且分配完全,簡化中間過程等優點,有利于提高 HSCCC的分離純化效率。

3.2 HSCCC分離條件的選擇

現有文獻多數報道使用 HSCCC分離黃酮苷的方法,而能夠高效分離制備多甲氧基黃酮的方法較少,體系主要為氯仿-甲醇-水,石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水,正己烷 -乙酸乙酯-甲醇 -水 。已有文獻報道使用石油醚∶乙酸乙酯 ∶甲醇 ∶水 (2∶4∶3∶3)可分離青皮中橙皮苷 、橘皮素 、5-羥基-6,7,8,3′,4′-五甲氧基黃酮。但對于使用 HSCCC同時分離六種 PMFs的方法尚無報道。本實驗選擇正己烷/水為主溶劑,分別通過調節溶劑體系在不同體積的配比,考察了青皮中各組分的分配系數,篩選出了對于本實驗中青皮粗提物的各組分整體分離效果較好、固定相保留率較高的體系。實驗結果見表 1。

表 1 青皮粗提物中六種化合物在不同比例的溶劑體系中的分配系數Table 1 Partition coefficients of six compounds of Pericarpium citriReticulatae Viride crude extracts in different p roportion solvent systems

從表 1中可以看出當溶劑體系為正己烷-乙酸乙酯-甲醇 -水 (3∶6∶3∶6)和 (2∶6∶2∶6)時,各組分的分配系數普遍較大,因此體系極性偏強不適合該粗提物的分離純化。而當體系為正己烷-乙酸乙酯-甲醇 -水 (5∶5∶5∶5)時各組分的分配系數都較小 ,這樣分配系數小的組分就容易與無保留的雜質相混淆并且出峰過快影響分離度;因此得出較適合的體系為正己烷 -乙酸乙酯-甲醇 -水 (4∶5∶4∶5)和 (4∶6∶4∶6),在其他實驗參數均相同的條件下,分別應用兩體系對青皮粗提物進行分離純化,結果證明正己烷-乙酸乙酯-甲醇 -水 (4∶6∶4∶6)在總的分離時間 ,以及對化合物 1～6分離純化等方面都優于正己烷-乙酸乙酯 -甲醇-水(4∶5∶4∶5),對于化合物 6采用回收分離管中溶液,甲醇重結晶的方法純化。因此本實驗最終選用正己烷-乙酸乙酯 -甲醇-水(4∶6∶4∶6)作為分離純化的溶劑體系。

本實驗還對樣品的一次進樣量進行了優化,考察了進樣濃度分別為 8、15、25 mg/mL時,對青皮粗提物分離的影響。當進樣濃度為 25mg/m L時,樣品的分離度較差,化合物 1、2不能有效分離。而當進樣量為 8mg/mL和 15 mg/mL時,樣品都有較好的分離度,且無明顯差別,因此本實驗選擇的進樣濃度為 15mg/m L。

3.3 HSCCC分離制備的結果

將“2.2”節得到的青皮樣品溶液按照“2.3”節所述步驟進行分離,固定相保留率為 50%,分離時間為 460min,根據 HSCCC圖(圖 2)手動分段收集,得到組分 1～5。將 5種組分減壓濃縮干燥,稱得質量分別為 3.5 mg、13.9 mg、51.3mg、9.5 mg、44.7 mg,組分 6經重結晶后得 11.2mg。

圖 2 青皮粗提取的高速逆流色譜圖Fig.2 HSCCC chromatogram of the crude extract For peaks 1-6,see Fig 1.

3.4 HPLC檢測分析

采用“2.4”節的條件,對青皮樣品及組分 1～6分別進行 HPLC檢測(圖 3,4),面積歸一化法測定六種化合物的純度為:97.8%、98.4%、100%、97.6%、99%、98.1%。此結果表明,利用高速逆流色譜對青皮中的活性化合物進行大量分離制備的方法高效可行。

圖 3 青皮粗提物的HPLC圖Fig.3 H igh performance liquid chromatography of Pericarpium citri Reticulatae Viride crude extracts Peaks 1-6,see Fig 1.

圖 4 從圖 2中分離得到的五種化合物的HPLC圖Fig.4 H igh performance liquid chromatography of five compounds(1、2、3、4、5)isolated by HSCCC.High performance liquid chromatography of recrystallized compound 6

3.5 結構鑒定

化合物 1 黃色針狀結晶(甲醇),mp.178～179℃,ESI-MSm/z:373[M+H]+。1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:7.44(1H,dd,J=8.9,2.1 Hz,H-6′),7.23(1H,d,J=2.1Hz,H-2′),6.92(1H,d,J=8.8Hz,H-5′),6.74(1H,s,H-8),6.55(1H,s,H-3),3.98(3H,s,OCH3),3.95(3H,s,OCH3),3.92(3H,s,OCH3),3.90(3H,s,OCH3),3.88(3H,s,OCH3)。1H NMR數據與文獻[6]基本一致,故鑒定化合物 1為 5,6,7,3′,4′-五 甲氧 基 黃酮,即甜橙素(Sinensetin)。

化合物 2 黃色粉末(甲醇),mp.216～217℃,ESI-MSm/z:343[M+H]+。1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:7.89(2H,d,J=8.9 Hz,H-2′,6′),7.02(2H,d,J=8.9 Hz,H-3′,5′),6.60(1H,s,H-3),6.44(1H,s,H-6),4.00(3H,s,OCH3),3.98(3H,s,OCH3),3.96(3H,s,OCH3),3.88(3H,s,OCH3);13C NMR(125 MHz,CDCl3):162.2(C-2),107.1(C-3),177.8(C-4),152.0(C-5),92.8(C-6),156.5(C-7),130.9(C-8),156.3(C-9),109.2(C-10),124.0(C-1′),127.7(C-2′),114.5(C-3′),160.7(C-4′),114.5(C-5′),127.7(C-6′),61.6(OCH3),56.7(OCH3),56.3(OCH3),55.5(OCH3)。NMR數據與文獻[6]一致,故鑒定此化合物 2為 5,7,8,4′-四甲氧基黃酮。

化合物 3 黃色針狀結晶(甲醇),mp.136～137℃,鹽酸-鎂粉反應呈橙紅色。ESI-MSm/z:403[M+H]+。1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:6.62(1H,s,H-3),7.42(1H,d,J=2.1 Hz,H-2′),7.00(1H,d,J=8.5 Hz,H-5′),7.57(1H,dd,J=8.5,2.1 Hz,H-6′),3.97(3H,s,OCH3),3.98(3H,s,OCH3),4.03(3H,s,OCH3),4.10(3H,s,OCH3),3.96(3H,s,OCH3),3.95(3H,s,OCH3);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:161.1(C-2),106.9(C-3),177.3(C-4),144.2(C-5),149.4(C-6),138.1(C-7),148.5(C-8),147.8(C-9),108.7(C-10),124.1(C-1′),111.3(C-2′),152.0(C-3′),151.5(C-4′),114.9(C-5′),119.7(C-6′),62.3(OCH3),62.0(OCH3),61.8(OCH33),61.7(OCH3),56.1(OCH3),56.0(OCH3).1H NMR、13C NMR數據與文獻[7]報道一致,故鑒定為 5,6,7,8,3′,4′-六甲氧基黃酮 ,即川陳皮素(Nobiletin)。

化合物 4 黃色針晶(乙酸乙酯),mp.125～127 ℃,ESI-MSm/z:433[M+H]+。1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:7.81(1H,d,J=1.9 Hz,H-2′),7.01(1H,d,J=8.6 Hz,H-5′),7.84(1H,dd,J=8.6,2.0 Hz,H-6′),4.10(3H,s,OCH3),4.01(3H,s,OCH3),3.98(3H,s,OCH3),3.97(3H,s,OCH3),3.97(3H,s,OCH3),3.95(3H,s,OCH3),3.89(3H,s,OCH3);13C NMR(125 MHz,CDCl3):151.1(C-2),143.9(C-3),173.9(C-4),146.8(C-5),140.8(C-6),151.3(C-7),137.9(C-8),148.2(C-9),115.1(C-10),123.5(C-1′),111.1(C-2′),148.9(C-3′),153.1(C-4′),111.2(C-5′),122.0(C-6′),62.3(OCH3),61.9(OCH3),61.8(0CH3),61.7(0CH3),59.9(0CH3),56.0(OCH3),56.0(OCH3)。 NMR數據與文獻[8]一致,故鑒定此化合物 4為 3,5,6,7,8,3′,4′-七甲 氧基 黃 酮 (3,5,6,7,8,3′,4′-Heptame-thoxyflavone)。

化合物 5 黃色針晶(甲醇),mp.49～51℃,ESI-MSm/z:373[M+H]+。1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:6.60(1H,s,H-3),7.88(2H,m,H-2′,6′),7.03(2H,m,H-3′,5′),3.95(3H,s,OCH3),3.95(3H,s,OCH3),4.02(3H,s,OCH3),4.10(3H,s,OCH3);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:62.3(C-2),106.8(C-3),177.3(C-4),147.8(C-5),144.1(C-6),151.4(C-7),138.1(C-8),148.4(C-9),106.8(C-10),123.9(C-1′),127.7(C-2′),114.6(C-3′),161.2(C-4′),114.5(C-5′),127.7(C-6′),62.3(OCH3),62.0(OCH3),61.8(OCH3),61.7(OCH3),55.5(OCH3)。以上 NMR數據與文獻[6]報道一致,故鑒定為 5,6,7,8,4′-五甲氧基黃酮,即橘皮素(Tangeretin)。

化合物 6 黃色針晶(乙酸乙酯),mp.144～145℃,ESI-MSm/z:388[M]+。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:7.59(1H,dd,J=8.5,2.1 Hz,H-6′),7.43(1H,d,J=2.1 Hz,H-2′),7.01(1H,d,J=8.5 Hz,H-5′),6.61(1H,s,H-3),4.11(3H,s,OCH3),3.99(3H,s,OCH3),3.98(3H,s,OCH3),3.97(3H,s,OCH3),3.96(3H,s,OCH3),12.54(1H,s,5-OH);13C NMR(125MHz,CDCl3):164.0(C-2),104.0(C-3),183.0(C-4),145.8(C-5),136.7(C-6),152.6(C-7),133.0(C-8),149.5(C-9),107.1(C-10),123.8(C-1′),108.9(C-2′),149.5(C-3′),153.0(C-4′),111.4(C-5′),120.2(C-6′),62.1(OCH3),61.7(OCH3),61.1(OCH3),56.2(OCH3),56.1(OCH3)。NMR數據與文獻[9]一致,故鑒定此化合物 6為 5-羥基 -6,7,8,3′,4′,-五甲氧基黃酮,即 5-去甲川陳皮素(5-O-DesmethylNobiletin)。

4 結論

本文首次研究了使用高速逆流色譜分離制備青皮中六種黃酮類成分的方法,分離產物經 HPLC,MS,NMR分析,結果證明該方法成功獲得高純度,高質量的多甲氧基黃酮類化合物。與常規反復過硅膠柱的方法相比,該方法具有快速,高效,節省溶劑等優點。 3,5,6,7,8,3′,4′-七甲氧基黃酮具有較強的抑制癌細胞增殖,并能促使癌細胞向正常細胞轉變,有較高的藥用價值。川陳皮素和橘皮素是我國藥典規定的青皮中的標志性成分,得到的高純度樣品可以作為標準品用于分析測試或藥理與毒理試驗,該方法也為分離相似化合物提供技術參考。

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