三種倍半萜類化合物體外抗腫瘤細胞增殖活性研究

于 峰,王思明,董 玫,倪志宇,董富潔,史清文*,鈴木信夫,叢 斌

1河北醫科大學法醫學系河北省法醫學重點實驗室,石家莊 050017;2河北醫科大學藥學院,石家莊 050017;3千葉大學醫學部環境影響生物化學教室,千葉市

菊科是有花植物中最大的科,含有 1100多個屬,23000～25000多種植物,很多菊科植物在各國民間藥用。土木香(Inula helenium)系菊科旋覆花屬植物,為多年生草本,其根供藥用,具有健胃、利尿、祛痰和驅蟲等功效[1]。性溫,味辛、苦。在我國分布于新疆,其它許多地區常栽培。藥理活性研究發現土木香內酯類成分有抗腫瘤細胞增殖作用和抗結核分支桿菌等作用[2,3]。旋覆花(Inula japonica)為菊科旋覆花屬植物,是多年生直立草本植物,主要分布于我國的東北、華北、西北及浙江、江蘇、四川和廣東等地區[1]。近年研究表明旋覆花的主要成分為倍半萜內酯類化合物,藥理活性方面有細胞毒性和抗微生物等報道[4,5]。本文對從土木香的根中和旋覆花得花中分離得到的三種主要倍半萜內酯化合物異土木香內酯(1)[6],1-氧-乙酰大花旋覆花內酯(2)[7]和大花旋覆花內酯(3)[7]進行了體外抗腫瘤細胞增殖活性的實驗,初步探討了這三種化合物結構與活性之間的構效關系。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

三種倍半萜類化合物:異土木香內酯(1),1-氧-乙酰大花旋覆花內酯(2)和大花旋覆花內酯(3)由史清文教授分別從菊科旋覆花屬土木香(Inula helenium)的根中和旋覆花(Inula japonica)的花中分離得到,均為白色針晶,經核磁共振光譜和質譜確定它們的結構如下(1～3),純度 99%。

1.2 藥品和試劑

噻唑藍(MTT,Sigma,M-2128);RPMI 1640培養基(GIBCO);胰蛋白酶(GIBCO);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);順鉑(Sigma,034k3693)。

1.3 細胞系和培養條件

試驗用腫瘤細胞株由日本千葉大學醫學部第二生物化學教室提供。U251SP:人腦神經膠質瘤細胞株[8];HLE:人肝癌細胞株[8];MM1-CB:人黑色素瘤細胞株[8];KT:人乳腺癌腦轉移腫瘤細胞株[8]。試驗用正常細胞由河北醫科大學基礎醫學院細胞生物學實驗室提供。HELF:正常人胚肺成纖維細胞。各腫瘤細胞株接種于直徑為 100mm的培養皿中,加入含 10%胎牛血清的 RPMI 1640培養基,37℃和5%CO2培養箱中培養。

1.4 方法

參照文獻[9]中的方法。將被試細胞懸浮接種于 96孔板,每孔 90μL(含 1×104個細胞),分別加入磷酸鹽緩沖液(PBS)、溶劑對照(終濃度 0.5%DMSO)、陽性對照順鉑和終濃度為 100、10和 1 μmol/L的化合物 1～3各 10μL,每組均設 3復孔,置于飽和濕度、37℃和 5%CO2培養箱中培養 72 h。于培養結束前 4 h,各培養孔加入 5mg/mL四氮唑鹽 (MTT)10μL,用酶聯免疫檢測儀測定各孔吸光度值(OD值),測定波長 λ=570 nm,參考波長 λ=630 nm,并計算細胞增殖抑制率,細胞增殖抑制率(%)=(1-OD對照組/OD實驗組)×100%。

1.5 統計學處理

數據用 x±s表示;兩組間數據用 t-檢驗,多組間數據用單因素方差分析。應用 SAS612統計軟件計算。

2 結果

2.1 化合物 1～3對體外培養的 U251SP細胞增殖的抑制作用

結果如圖 1所示,陽性對照順鉑顯示較強的抑制人腦神經膠質瘤細胞(U251SP)增殖活性的作用,1、10和 100μmol/L順鉑處理 U251SP細胞后,腫瘤細胞抑制率分別為 24.62、47.71和 69.99;化合物 1用相同的劑量處理 U251SP細胞后,其腫瘤細胞增殖抑制率與順鉑幾乎相同,分別為 21.48、54.56和72.20,并且與空白對照組相比較極顯著性差異,提示化合物 1有較強的抑制 U251SP細胞增殖的作用。通過腫瘤細胞增殖抑制率對順鉑和化合物 1濃度的對數回歸方程 y=9.8521lnx+24.755和 y=11.014lnx+24.053,得到順鉑和化合物 1對U251SP細胞增殖的半數抑制濃度(IC50)分別為12.97和 10.55μmol/L。化合物 2和 3對 U251SP細胞的增殖不顯示抑制活性。

圖 1 三種倍半萜內酯化合物對人腦神經膠質瘤細胞增殖的影響Fig.1 Effect of three compounds on the proliferation of U251SP tumor cell line

2.2 化合物 1～3對體外培養的人肝癌細胞增殖的抑制作用

結果如圖 2所示,陽性對照順鉑對人肝癌細胞(HLE)增殖幾乎不顯示抑制活性,即使用 100 μmol/L順鉑處理 HLE細胞,其腫瘤細胞抑制率僅為 14.01%,而用 1、10和 100μmol/L的化合物 1處理 HLE細胞后,其腫瘤細胞抑制率分別為 21.42、36.56和 64.13,與空白對照組相比較極顯著性差異,并且呈現較好的劑量以來關系,提示化合物 1有較強的抑制 HLE細胞增殖的作用。化合物 2只在100μmol/L劑量組顯示較強的腫瘤細胞增殖抑制活性,其腫瘤細胞增殖的抑制率為 55.67,而化合物3對 HLE細胞的增殖不顯示抑制活性。

圖 2 三種倍半萜內酯化合物對人肝癌細胞增殖的影響Fig.2 Effect of three compounds on the proliferation of HLE tumor cell line

2.3 化合物 1～3對體外培養的人黑色素瘤細胞增殖的抑制作用

結果如圖 3所示,陽性對照順鉑對人黑色素瘤細胞(MM 1-CB)增殖幾乎不顯示抑制活性,即使用100μmol/L順鉑處理 MM 1-CB細胞,其腫瘤細胞抑制率僅為 8.98%,而用 1、10和 100μmol/L的化合物 1處理 MM1-CB細胞,其腫瘤細胞增殖抑制率分別為 13.77、61.44和 87.03,與空白對照組相比較極顯著性差異,并且呈現較好的劑量以來關系,提示化合物 1有較強的抑制 MM1-CB細胞增殖的作用。化合物 2只在 100μmol/L劑量組顯示中等程度的腫瘤細胞增殖抑制活性,其腫瘤細胞增殖抑制率為39.13,而化合物 3對 MM1-CB細胞的增殖不顯示抑制活性。

圖 3 三種倍半萜內酯化合物對人黑色素瘤細胞增殖的影響Fig.3 Effectof three compounds on the proliferation of MM 1-CB tumor cell line

2.4 化合物 1～3對人乳腺癌腦轉移腫瘤細胞增殖抑制活性的影響

陽性對照順鉑對人乳腺癌腦轉移腫瘤細胞(KT)的增殖顯示較強的抑制活性,IC50僅為 6.26 μmol/L,而化合物 1對 KT細胞的增殖顯示中等程度的抑制活性,IC50為 48.52μmol/L,化合物 2和 3對 KT細胞增殖不顯示抑制活性,IC50均大于 100 μmol/L。

2.5 化合物 1～3對人胚肺成纖維細胞增殖抑制活性的影響

實驗結果如圖 4所示,陽性對照順鉑對人胚肺成纖維細胞(HELF)的增殖呈現較強的抑制活性,IC50為 16.89μmol/L,化合物 1僅在 100μmol/L劑量組顯示較低的細胞增殖抑制活性,其細胞增殖抑制率為 22.54,其它兩種試驗用化合物對 HELF細胞的增殖不顯示抑制活性,三種被試化合物的 IC50均大于 100μmol/L。

圖 4 三種倍半萜內酯化合物對人胚肺成纖維細胞增殖的影響Fig.4 Effect of three compounds on the proliferation of Human embryonic lung fibroblast

3 討論

癌癥是威脅人類健康的一大兇手,是僅次于心腦血管疾病的第二大致死性疾病(如果將心血管疾病和腦血管疾病分開統計,癌癥則位于第一位),嚴重地威脅人類的健康和生命。現在臨床上應用的抗癌藥物雖然種類不少,但價格昂貴,毒副作用嚴重,且尚沒有治療某些癌癥的特效藥。因此尋找療效確切,作用機理清楚,治愈率高,毒副作用小的抗癌藥物,攻克癌癥成為全世界醫藥工作者亟待解決的一大課題。植物在其漫長的進化過程中合成了許許多多結構各異的次生代謝天然產物,這些次生代謝產物不僅具有不同的生物活性,還常常被發現有新的作用機制,象紫杉醇(Taxol·)、長春新堿(Vincristine,VCR)、喜樹堿(Camptothecin,CPT)就是從植物中發現的三個優秀的天然抗癌藥物中的代表,但彼此具有三個不同的甚至完全相反的抗癌作用機制,這些天然藥物的發現和在臨床上的廣泛應用,極大地推動了化學家和藥學家對抗癌藥物的研發,并極大地促進了病理學家和生物學家對抗癌作用機理的研究[10,11]。據統計,目前使用的化學藥物中,30%以上是天然化合物經結構修飾產生的,而臨床上應用的抗癌藥物 74%來源于天然產物和天然產物的衍生物或是因受天然產物結構的啟發而設計的合成藥物。從包括植物在內的自然界中尋找發現高效低毒的抗癌活性成分或先導化合物一直是國內外藥物學家十分關注的課題和研究的熱點[12-29]。用中草藥治療癌癥在我國有著悠久的歷史和豐富的臨床經驗,用現代的方法研究其活性成分及其作用機制是發現新的先導化合物研制開發新型抗癌藥物的一條捷徑。

菊科旋覆花屬植物含有豐富的倍半萜內酯類化合物,很多倍半萜內酯類化合物都顯示有不同程度的抗腫瘤活性。楊超等于 2003年報道了旋覆花地上部分的倍半萜內酯類成分對腫瘤細胞 SMMC-7721以及 HO-8910具有細胞毒作用[4]。

本實驗研究結果顯示,三個倍半萜內酯類化合物中,異土木香內酯對人腦神經膠質瘤細胞、肝癌細胞、人黑色素瘤和人乳腺癌腦轉移腫瘤細胞的增殖均有明顯的抑制作用,對于正常的細胞,即人胚肺成纖維細胞的增殖不呈現抑制活性,而 1-氧-乙酰大花旋覆花內酯僅在 100μmol/L的高濃度下,對人肝癌細胞和人黑色素瘤細胞的增殖顯示中等程度的抑制活性,大花旋覆花內酯對人腦神經膠質瘤細胞、肝癌細胞、人黑色素瘤和人乳腺癌腦轉移腫瘤細胞的增殖不顯示任何抑制活性。從結構上分析異土木香內酯(1)屬于桉葉烷型(Eudesmane)倍半萜內酯,A環和 B環呈反式聚合,7,8位含有一個 α,β-不飽和的五員內酯環。1-氧-乙酰大花旋覆花內酯(2)和大花旋覆花內酯(3)都屬于 1,10-開環的桉葉烷型(1,10-Seco-eudesmane)倍半萜內酯,二者在 5位均有一個含有 5個碳原子的側鏈,由此推測 A環開環可能是導致 1-氧-乙酰大花旋覆花內酯(2)和大花旋覆花內酯(3)對人腦神經膠質瘤細胞、肝癌細胞、人黑色素瘤和人乳腺癌腦轉移腫瘤細胞的增殖不顯示抑制活性的原因。

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