草莓果膠裂解酶RNA干擾表達載體構(gòu)建

錢春 何橋 翟軍鵬 宋波 夏蓓蓓 張興國 梁國魯

（西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶 400715）

草莓（Fragaria ananassa Duch.）果實色澤鮮紅、柔軟多汁，營養(yǎng)豐富，老少皆宜。防止草莓果實成熟軟化，延長草莓果實貨架壽命，是草莓生產(chǎn)中亟需解決的問題。草莓屬典型的非躍變型果實（Knee et al.，1977；Perkins-Veazie et al.，1988），許多研究表明這類果實成熟軟化與細胞壁結(jié)構(gòu)的變化及多糖（果膠、纖維素、半纖維素）的降解密切相關(guān)，軟化主要是由于皮層薄壁組織細胞壁胞間層的降解增加果膠釋放所致（Neal，1965；Knee et al.，1977；Abeles & Takeda，1990），果膠裂解酶（pectate lyase，PL）是新發(fā)現(xiàn)的一種降解果膠物質(zhì)從而導(dǎo)致果實軟化的酶，被認為是通過分子改良果實硬度、阻止草莓果實軟化的優(yōu)秀候選基因（Yoder et al.，1993）。目前國內(nèi)外對草莓硬度改良多采用傳統(tǒng)的雜交育種，基因工程主要是利用反義 RNA技術(shù)（Wooley &James，2001；Jimenez-Bermudez et al.，2002；Palomer et al.，2006），國內(nèi)外尚沒有利用雙鏈 RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)改良草莓硬度方面的報道。

本試驗構(gòu)建了草莓PL基因的RNAi表達載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)成功轉(zhuǎn)入到草莓植株中，為基因工程手段培育硬肉型草莓提供新種質(zhì)和育種材料開辟了新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2008年12月～2009年7月在重慶市蔬菜學(xué)重點實驗室進行。供試材料為本實驗室保存的豐香草莓無菌苗；大腸桿菌菌株DH5α、植物表達載體p2024（抗Kan，GFP標記基因）、農(nóng)桿菌菌株LBA4404由本實驗室保存。 pMD18-T載體及所有內(nèi)切酶均購自TaKaRa公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒、植物基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小量制備試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；卡那霉素（Kan）、氨芐青霉素（Amp）、羧卞青霉素（Cb）、鏈霉素（Str）、利福平（Rfp）購自北京天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PL基因片段克隆 根據(jù)已發(fā)表的草莓PL基因的cDNA序列（GenBank登錄號為U63550），利用Clustalx1.83和Genedoc2.0軟件，與其他物種的PL基因同源序列進行分析比較，確定PL基因的保守片段。根據(jù)RNA干擾所需的雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)要求，利用Primer Premier5.0，設(shè)計合成特異引物，上游引物 sp1：5’GTGGATTGTGTTCAAGCGTGACATGG 3’；下游引物 sp2：5’CAGCATAACCTGTTCCAATAAACC 3’。對草莓DNA進行PCR擴增，PL基因保守片段長度382 bp的外顯子作為發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖（sense-PL，s-PL）及緊鄰的106 bp內(nèi)含子（intron）作為發(fā)夾結(jié)構(gòu)的環(huán)，構(gòu)成PL基因RNA干擾載體的長片段。

PCR反應(yīng)參數(shù)：98 ℃預(yù)變性1 min，98 ℃ 10s，55.3 ℃ 15 s，72 ℃ 30s，30個循環(huán)，最后72 ℃ 10min。擴增完畢，1 %瓊脂糖電泳檢查。

1.2.2 PCR產(chǎn)物的克隆與測序 由于采用 Pfu高保真酶擴增，擴增產(chǎn)物3’端為平末端，膠回收PCR平末端產(chǎn)物，進行3’- 末端加A反應(yīng)，然后連接到克隆載體pMD18-T上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂布在含Amp 50mg·L-1的X-gal/IPTG的LB培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)16 h。挑選白色單菌落，PCR擴增鑒定陽性克隆并確定方向，重組質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，獲得陽性克隆載體pMD-siPL。

將pMD-siPL用HindⅢ/SalⅠ雙酶切，回收目標片段siPL，與上述回收的r-PL進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5α感受態(tài)細胞，培養(yǎng)方法同上，挑選單菌落進行PCR擴增，獲得RNA干擾克隆載體pMD-sirPL（圖1）。

用XbaⅠ/PmaCⅠ對pMD-sirPL雙酶切回收小片段，用Ecl136/XbaⅠ對表達載體p2024（圖2）雙酶切回收大片段，連接及轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5α感受態(tài)細胞，涂板，PCR檢測陽性克隆，對有目標片段的陽性克隆，挑菌，在含Kan 100mg·L-1的LB培養(yǎng)基搖菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，重組質(zhì)粒采用PCR法和限制性內(nèi)切酶酶切法鑒定。最后獲得RNA干擾表達載體p2024-sirPL（圖3）。

圖1 草莓RNA干擾克隆載體pMD-sirPL

圖2 植物表達載體p2024基因片段及酶切位點

1.2.4 草莓PL RNAi基因的轉(zhuǎn)化 重組質(zhì)粒用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細胞，在含Rfp 100mg·L-1、Kan 100mg·L-1及 Str 100mg·L-1的 YEP平板上篩選培養(yǎng)，利用引物sp2/p44、sp4/p45對陽性克隆進行PCR鑒定（引物p44、p45為植物表達載體上的一段堿基序列，序列是p44：ATGACGCACAATCCCACTATC；p45：ATCGCAAGACCGGCAACAG）。將鑒定正確的陽性農(nóng)桿菌單菌落搖菌，用于草莓葉片轉(zhuǎn)化。

1.2.5 草莓外植體的轉(zhuǎn)化 對草莓的轉(zhuǎn)化采用葉盤法。選取豐香草莓無菌苗幼嫩葉片（培養(yǎng)25 d左右），切成0.5 cm×0.5 cm小塊，浸泡在培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌液（OD600值0.6）中8～10min，用無菌濾紙吸干多余菌液，共培養(yǎng)2～3 d，至農(nóng)桿菌生長剛好覆蓋傷口表面，轉(zhuǎn)入抗性芽篩選培養(yǎng)基：MS+TDZ 2.0mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+Kan 45 mg·L-1+Cb 300mg·L-1；增殖培養(yǎng)基為：MS+6-BA 0.3 mg·L-1+NAA 0.01 mg·L-1+Kan 45 mg·L-1+Cb 100mg·L-1；生根培養(yǎng)基：MS+Kan 45 mg·L-1+Cb 100mg·L-1。提取轉(zhuǎn)基因植株葉片DNA，利用引物sp2/p44、sp4/p45進行PCR擴增，檢測干擾基因是否整合到草莓植株，并利用引物 p144/p256進行 PCR擴增，排除假陽性的可能（p256為干擾載體左邊界外一段引物序列：AACCCGGCAGCTTAGTTGCCGT；p144為干擾載體上一段序列：TTCAGGGAGTCACGTTATGAC）。

圖3 草莓RNA干擾載體p2024-sirPL構(gòu)建

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓PL基因的克隆與序列分析

用sp1/sp2引物對草莓提取的DNA進行PCR擴增，獲得的產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳，獲得488 bp左右的擴增片段（圖4），與設(shè)計擴增片段基本一致。

凝膠回收PCR擴增片段，并與pMD18-T載體連接，質(zhì)粒經(jīng)測序，其結(jié)果與發(fā)表的草莓DNA序列（GenBank登錄號為AF339024.1）進行對比，只有一個堿基不同，同源性達到99.8 %。利用引物 p240/sp2、sp1/p264（引物 p240、p264是克隆載體上的堿基序列，序列為 p240：AGCGGATAACAATTTCACACAGG；p264：GTAACGCCAGGGTTTTCCCA），對篩選獲得的陽性克隆質(zhì)粒pMD18- siPL進行正反PCR驗證，結(jié)果均有目標片段。

用sp3/sp4對質(zhì)粒pMD18-siPL進行PCR擴增，獲得328 bp的PL基因RNA干擾載體的反向重復(fù)序列r-PL（圖5）。

圖4 PL基因長片段克隆

圖5 PL基因RNA干擾載體的反向重復(fù)序列擴增

2.2 植物RNA干擾表達載體的構(gòu)建及鑒定

siPL與r-PL基因片段通過連接、轉(zhuǎn)化，獲得的重組質(zhì)粒pMD18-sirPL經(jīng)過XbaⅠ/PmaCⅠ雙酶切鑒定，獲得預(yù)期的870bp目標片段（圖6）。

草莓RNAi表達載體p2024-sirPL重組質(zhì)粒用引物sp2/p44進行PCR擴增，獲得550bp左右的目標片段（圖7），同時用EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切質(zhì)粒p2024-sirPL，獲得1980bp的目標片段（圖8），說明RNA干擾載體構(gòu)建成功。

圖6 草莓克隆載體pMD18-sirPL酶切鑒定

圖7 草莓RNAi表達載體PCR檢測

2.3 農(nóng)桿菌PCR鑒定

將p2024-sirPL導(dǎo)入LBA4404，對培養(yǎng)的農(nóng)桿菌液用兩對特異引物sp2/p44、sp4/p45分別能擴增出約550bp和480bp的兩條片段，表明雙元質(zhì)粒載體p2024-sirPL已導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌中（圖9）。

圖8 草莓RNAi表達載體酶切鑒定

圖9 含RNAi目的片段的農(nóng)桿菌PCR檢測

2.4 對草莓的轉(zhuǎn)化

經(jīng)農(nóng)桿菌液浸泡的豐香草莓葉盤，在進行Kan篩選培養(yǎng)時，大量葉盤開始培養(yǎng)出少量愈傷，后變白死亡，少量葉盤愈傷可以繼續(xù)膨大，分化出綠色芽點（圖10）。通過在Kan篩選培養(yǎng)基上增殖生根培養(yǎng)，獲得2個轉(zhuǎn)基因株系（圖11），利用sp2/p44和sp4/p45兩對引物進行PCR擴增，均能擴增出理想的目標片段（圖12），利用引物p144和p256進行PCR擴增，排除了轉(zhuǎn)基因株系假陽性（圖13），說明外源RNA干擾PL基因已經(jīng)整合到草莓植株中。

圖10 草莓葉片Kan篩選培養(yǎng)獲得不定芽

圖11 草莓抗性芽增殖

圖12 轉(zhuǎn)基因草莓的PCR檢測

3 討論

RNA干擾是廣泛存在真核生物中，通過正反義RNA形成雙鏈RNA特異性地抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄后表達的現(xiàn)象。RNAi具有特異、高效、放大的特點，雙鏈RNA的抑制作用要比單獨用反義RNA的抑制作用高出10倍以上（Davenport，2001）。本試驗成功構(gòu)建了草莓果膠裂解酶的RNA干擾載體，并已轉(zhuǎn)入草莓植株中，但對草莓果實硬度的影響還需進一步將轉(zhuǎn)基因草莓生根，轉(zhuǎn)入大田栽培，對相關(guān)指標進行分析后獲得。同時由于35 s是組成型啟動子，基因的表達會在草莓的各個組織中得到表達，試驗獲得的干擾載體是否會顯著影響草莓的生長及代謝，還需要對轉(zhuǎn)基因草莓相關(guān)生理指標進行測定后獲得結(jié)論。

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