番茄葉色黃化突變體的遺傳分析及SSR分子標記

郭 明 張 賀 李景富

（東北農業大學園藝學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

葉色突變是自然界比較常見的一種突變，由于突變基因往往是直接或間接影響葉綠素的合成和降解，改變葉綠素含量，所以葉色突變體也稱為葉綠素突變體（何冰 等，2006）。對葉色突變的研究開始得較早，在20世紀30年代就有報道，在水稻（吳殿星 等，1997）、大豆（Honeycutt et al.，1990；馬國榮 等，1994）、大麥（史俊通 等，1998）、小麥（蘇小靜 等，1990）、棉花（肖松華 等，1995）、西瓜（Whitaker，1952）等多種作物中獲得了此類突變體。研究表明，葉色突變體作為一種特殊的材料，對研究高等植物的光合機理（Fambrini et al.，2004）、葉綠素的生物合成、葉綠體的結構、功能與發育以及它們的分化和遺傳控制（Parks & Quail，1991）、分析鑒定基因功能（Hansson et al.，1999）、了解基因間互作（Lopez-Juez et al.，1998）有特殊價值，同時在育種工作中，葉色突變作為標記性狀用于簡化良種繁育和雜交制種，在生產實踐中具有重要的意義。國內外關于葉色突變體的研究主要集中在水稻、小麥等大田作物，而關于番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）葉色突變的報道較少。Terry和Kendrick（1999）報道番茄黃葉突變體au和yg-2為核隱性基因突變，分別是血紅色素加氧酶和植物光敏色素合酶基因發生突變。王彥杰等（2007）以葉黃素缺失的番茄突變體為材料，研究葉黃素合成突變與光能分配和抗氧化酶活性的關系，結果表明葉黃素缺失體主要通過降低光能吸收和提高抗氧化能力來避免過剩光能導致光氧化脅迫的產生。

東北農業大學番茄課題組于1998年在田間露地種植的中蔬 4號中發現自然突變的番茄葉色突變株，該突變株葉色黃化，成株苗葉片有黃斑，結果前期果實發白，轉色慢，但果實能正常轉為紅色，果實硬度大。將該突變株單獨留種，經過多代自交形成遺傳穩定的黃葉突變系。發現初期以果實顏色命名該突變體為番茄“白化”突變體（李景富 等，2006），后更名為番茄葉色黃化突變體。本試驗對該番茄葉色黃化突變體的遺傳和相關基因的初步定位進行研究，旨在為今后該基因的精細定位、克隆及其在育種中的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試番茄材料及遺傳分析和定位群體的構建

突變體材料：番茄葉色黃化突變體06883，系番茄中蔬4號06884中發現的自然突變株，經6 a觀察，突變性狀能夠穩定遺傳。常規材料：中蔬4號06884，栽培品種04973。以上材料均由東北農業大學番茄研究所提供。利用番茄葉色黃化突變體06883與中蔬4號配制正反雜交組合，F1自交獲得F2。F2群體用于番茄葉色黃化性狀的遺傳分析。將番茄葉色黃化突變體06883與04973雜交。F1自交獲得F2，該群體用于相關基因的分子定位。

1.2 遺傳分析方法

利用人工去雄、授粉的常規有性雜交法，將葉色黃化突變體與中蔬4號進行正反交試驗。F1單粒留種，單株收獲并貯藏。在苗期分別觀察統計 F1、F2表型和植株數，并對統計結果進行χ2檢測。

1.3 DNA的提取

取番茄鮮嫩葉片，采用CTAB法提取親本和群體單株DNA，參照王關林和方宏筠（2002）的方法略作修改。用 Eppendouf蛋白核酸測定儀測定 DNA濃度，然后用去離子水將其稀釋至 50ng·μL-1。

1.4 番茄黃化突變基因的SSR分子標記

共選用339對SSR引物用于篩選與葉色黃化突變基因連鎖的標記，SSR引物序列分別來自SOL Genomics Network（http：//www.sgn.cornell.edu/index.pl）及文獻（Suliman-Pollatschek et al.，2002；He & Poysa，2003），覆蓋番茄的12條染色體，能夠對葉色黃化突變基因進行初步定位。引物由上海生工生物工程有限公司合成。反應體系：模板 DNA 20ng，1×PCR Buffer，dNTP 0.2 mmol·L-1，MgCl22.0mmol·L-1，引物 0.3 μmol·L-1，Taq DNA polymerase 1 U，加 ddH2O 補至20μL。在BiometraPCR儀上進行擴增，反應條件為：94 ℃下預變性5 min，94 ℃下變性1 min，Tm值（45～55 ℃）下退火1 min，72 ℃下延伸2 min，38個循環；最后72 ℃下延伸10min后保存在4 ℃條件下。反應產物加入5 μL變性液，在PCR儀中95 ℃變性5 min后立即置于冰水混合物中。用6 %的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，100V電泳約1 h。最后銀染顯色分析。

1.5 數據分析

SSR為共顯性標記，分離后代同父本04973的純和帶型記為“1”，同母本06883的純和帶型記為“2”，兩親本的雜合帶型記為“3”，帶型模糊或缺失記為“0”。利用Mapmaker/EXP 3.0構建分子標記連鎖圖譜，應用Mapchart 2.1軟件繪制遺傳圖譜。

2 結果與分析

2.1 葉色黃化突變體的表型特征

06883葉色黃化突變體經連續6 a觀察，群體均表現出黃化，無分離現象，性狀穩定。該突變體子葉顏色展平時與正常植株一樣為綠色，約10d后，突變體子葉顏色漸漸變黃，且顏色均勻。隨著苗齡的延長，新出的真葉為正常綠色，至四葉一心期，第一片真葉從葉尖邊緣向葉基部開始失綠，直至整個葉片變黃，最后衰老、死亡的葉片顏色幾乎為白色。在植株生長過程中，葉片變黃的同時，主莖顏色也由綠色慢慢變成黃色，且靠近土壤的植株莖部顏色呈淡紫紅色。葉色黃化突變體與正常植株葉色有明顯差異，表現出不同程度的黃化現象，由下至上，黃化程度依次減弱，僅新出葉片為綠色，而突變體與正常植株在生長勢上沒有顯著差異。突變體果實呈白色，轉色非常慢，但成熟后期能夠轉為紅色，且果實產量與中蔬4號06884差異不顯著，硬度大，耐貯藏。

2.2 葉色黃化突變體的遺傳分析

葉色黃化突變體06883與中蔬4號的正反交試驗顯示，F1群體均表現為正常植株葉色，觀察結果說明葉色黃化性狀為隱性性狀。其F2群體均分化出葉色黃化突變株和正常綠色株兩種類型，說明葉片黃化性狀受主效基因控制。F2中綠葉和黃化葉的分離比值都接近3∶1（表1），卡方測驗差異均不顯著。說明該性狀是受1對隱性主效核基因控制。

表1 中蔬4號與葉色黃化突變體06883正反交后代的分離表現

2.3 番茄葉色黃化基因的定位

用SGN上已經公布在1～12條染色體上的159對SSR標記和相關文獻上的188對SSR引物，對突變體和普通栽培品種04973進行多態性分析，經過初步篩選，發現共有20對SSR標記在兩親本之間表現出多態性。再利用BSA法在F2中建立混合基因池，對這20對引物進行再次篩選，最終發現有13對引物表現與分離群體表現一致。進一步用這13對多態性SSR標記對F2群體225個單株進行連鎖分析，最終有3對引物與該突變基因連鎖。3對引物的名稱及序列見表2。

表2 與突變基因連鎖的SSR引物名稱及序列

結果發現番茄葉色黃化基因位于第11條染色體上，與LEaat006、LEtat002和Tom196-197連鎖，與它們的連鎖距離分別為8.9、16.3和18.7cM（圖2）。Tom196-197在分離群體黃綠葉個體中的表現見圖1。

圖1 SSR引物Tom196-197在兩親本質檢的多態性及其在F2部分分離群體中的分離情況

3 討論

葉色突變是自然發生突變頻率較高的一種變異，造成葉色突變的原因很多，突變的類型也較多（苗晗 等，2007）。目前報道比較常見的是溫敏型葉色突變體，如溫敏型水稻葉色突變體W1在高溫下幼苗為正常綠色，而在低溫（15～20℃）下表現白化（崔海瑞 等，2001）；小麥返白系在苗期表現正常，但春季小麥返青時，返白系自心葉基部白化，后自下而上逐葉白化面積加大，隨溫度升高，又自心葉基部復綠（郭藹光 等，1991）。而另一類常見的葉色突變體的表現不受環境影響，如國艷梅等（2003）從黃瓜雌性系9110G中發現能夠穩定遺傳的葉色突變體；在水稻品種武運粳7號中發現黃綠葉自然突變體（王軍 等，2006）；曹莉等（2006）在小麥西農 1718高代品系中發現自發黃化突變體等。此類突變體的葉色突變性狀能夠穩定遺傳，不受環境影響，能夠作為葉色指示性狀的標準，可以應用于苗期標記輔助選擇育種中。本課題組發現的葉色黃化突變體是自然誘發的葉色突變體，經連續多代自交后發現是能穩定遺傳不受環境影響的葉色突變體。遺傳分析表明，該葉色黃化性狀受1對隱性核基因控制，田間特征表現為子葉展開15 d后變為黃色，真葉于四葉一心期開始轉色，莖為黃色而莖根部為淡紫紅色，這些性狀都可以作為苗期標記性狀應用于育種工作中。

某些葉色突變體具有特殊的優良性狀，為作物遺傳育種提供了優秀的種質資源。Gan和Amasino（1995）曾用轉基因技術誘發了1個煙草常綠突變體，此種突變體的生物學產量和種子產量分別增加了40%和52 %。陸地棉黃綠苗突變體浙12-12N幼苗期真葉葉綠素含量僅為常綠苗泗棉2號的66 %，其各葉位葉片的水分利用率、光能利用率及凈光合速率卻高于泗棉2號，其子棉產量和皮棉產量較泗棉2號有所提高（戴日春 等，1995）。張賀（2008）對番茄葉色黃化突變體的光合特性進行研究發現，在高光照強度下突變體的凈光合速率降低的幅度高于正常葉色植株，但在低光照強度（200μmol·m-2·s-1）下突變體凈光合速率卻高于正常葉色植株，說明該突變體是較好的耐弱光材料。同時，孟凡娟等（2006）對番茄葉色黃化突變體果實的研究發現，突變體果實內色素含量低于正常品種，耐貯性和硬度都優于正常品種，但與一般耐貯品種品質相比，突變體果實的品質與正常品種相差不大。

番茄葉色突變體報道研究較深入的是au和yg-2突變體（Terry & Kendrick，1996；van Tuinen et al.，1996），Balint-Kurti等（1995）應用RFLP技術將au基因定位在第11條染色體上，van Tuinen等（1997）同樣應用 RFLP技術驗證了 Kerr（1979）提出的 yg-2基因可能在第12條染色體上的結論。本課題組前期已經對該葉色黃化突變體的形態、生理性狀等進行了系統的研究。本試驗中，應用SSR分子標記技術對番茄葉色黃化突變體進行了初步定位，將相關突變基因定位在第11條染色體上兩個標記LEaat006和LEtat002之間，后續的工作將對LEaat006和LEtat002區段進行新標記的開發及精細作圖，并為最終圖位克隆該基因奠定基礎。

圖2 番茄葉色黃化控制基因的遺傳定位

曹莉，王輝，孫道杰，馮毅.2006.小麥黃化突變體光合作用及葉綠素熒光特性研究.西北植物學報，26（10）：2083-2087.

崔海瑞，夏英武，高明尉.2001.溫度對水稻突變體W1葉色及葉綠素生物合成的影響.核農學報，15（5）：269～273.

戴日春，薛建明，朱軍.1995.陸地棉新的黃綠苗突變體浙12-12N葉綠體含量與凈光合速率研究.棉花學報，7（3）：145-149.

郭藹光，王振鎰，汪沛洪.1991.小麥返白系的白化特征及其與環境因素的關系.西北植物學報，11（5）：122-126.

國艷梅，顧興芳，張春霞，方秀娟，張圣平，徐彩青.2003.黃瓜葉色突變體遺傳機制的研究.園藝學報，30（4）：409-412.

何冰，劉玲瓏，張文偉，萬建民.2006.植物葉色突變體.植物生理學通訊，42（1）：1-9.

李景富，孟凡娟，許向陽，康立功.2006.番茄“白化”突變體的發現及作為育種材料的鑒定.園藝學報，33（2）：384.

馬國榮，劉佑斌，蓋鈞鎰.1994.大豆細胞質遺傳芽黃突變體的發現.作物學報，20（3）：334-337.

孟凡娟，許向陽，李景富.2006.番茄“白化”突變體果實的幾個生理生化特性檢測.植物生理學通訊，42（1）：109-110.

苗晗，顧興芳，張圣平，王曉武.2007.蔬菜葉色突變體研究進展.中國蔬菜，（6）：39-42.

史俊通，宋璐，高如嵩.1998.大麥葉色轉換突變系轉色機理及其調控研究.西北農業學報，7（2）：28-31.

蘇小靜，汪沛洪，陳毓荃.1990.小麥突變體返白系返白機理的研究：Ⅱ、返白階段葉綠素代謝變化研究.西北農林科技大學學報：自然科學版，18（3）：80-84.

王關林，方宏筠.2002.植物基因工程.北京：科學出版社.

王軍，王寶，周麗慧，徐潔芬，顧銘洪，梁國華.2006.一個水稻新黃綠葉突變體基因的分子定位.中國水稻科學，20（5）：455-459.

王彥杰，夏曉劍，周艷虹，喻景權.2007.番茄葉黃素合成突變與光能分配和抗氧化酶活性的關系.園藝學報，34（5）：1301-1304.

吳殿星，夏英武，舒慶堯，張耀洲，劉貴付.1997.利用RAPD技術檢測轉綠型白化突變系W25基因組的變化.核農學報，11（2）：89-92.

肖松華，張天真，潘家駒.1995.陸地棉芽黃突變體的遺傳及在雜種優勢上的利用.南京農業大學學報，18（3）：28-33.

張賀.2008.番茄突變體葉片黃化生理機制及相關基因克隆〔博士論文〕.哈爾濱：東北農業大學.

Balint-Kurti P J，Jones D A，Jones J D G.1995.Integration of the classical and RFLP linkage maps of the short arm of tomato chromosome 1.Theor Appl Genet，90：17-26.

Fambrini M，Castagna A，Vecchia F D，Degl’ Innocenti E，Ranieri A，Vernieri P，Pardossi A，Guidi L，Rascio N，Pugliesi C.2004.Characterization of a pigment-deficient mutant of sunflower（Helianthus annuus L.）with abnormal chloroplast biogenesis，reduced PS Ⅱactivity and low endogenous level of abscisic acid.Plant Sci，167：79-89.

Gan S，Amasino R M.1995.Inhibition of leaf senescence by auto regulated production of cytokinin.Science，270：1986-1988.

Hansson A，Kannangara C G，van Wettstein D，Hansson M.1999.Molecular basis for semidominance of missense mutations in the XANTHA-H（42-kDa）subunit of magnesium chelatase.Proc Nat Acad Sci USA，96（4）：1744-1749.

He C V，Poysa K Y.2003.Development and characterization of simple sequence repeat（SSR）markers and their use in determining relationships among Lycopersicon esculentum cultivars.Theor Appl Genet，106：363-373.

Honeycutt R J，Newhouse K E，Palmer R G.1990.Inheritance and linkage studies of a variegated leaf mutant in soybean.Journal of Heredity，81（2）：123-126.

Kerr E A.1979.Yellow-green-2（yg-2）may be on chromosome 12.Tomato Genet Coop Rep，29：27.

Lopez-Juez E，Jarvis R P，Takeuchi A，Page A M，Chory J.1998.New Arabidopsis cue mutants suggest a close connection between plastid and phytochrome regulation of nuclear gene expression.Plant Physiol，118：803-815.

Parks B M，Quail P H.1991.Phytochrome-deficient hy1 and hy2 long hypocotyls mutants of Arabidopsis are defective in phytochrome chromophore biosynthesis.Plant Cell，3：1177-1186.

Suliman-Pollatschek S，Kashkush K，Shats H，Hillel J，Lavi U.2002.Generation and mapping of AFLP，SSRs and SNPs in Lycopersicon esculentum.Cellular & Molecular Biology Letters，7：583-597.

Terry M J，Kendrick R E.1996.The au and yg-2 mutants of tomato are deficient in phytochrome chromophore synthesis.Biol Chem，271：21681-21686.

Terry M J，Kendrick R E.1999.Feedback inhibition of chlorophyll synthesis in the phytochrome chromophore-deficient aurea and yellow-green-2 mutants of tomato.Plant Physiol，119：143-152.

van Tuinen A，Hanhart C J，Kerckhoffs L H J，Nagatani A，Boylan M T，Quail P H，Kendrick R E，Koornneef M.1996.Analysis of phytochrome-deficient yellow-green-2 and aurea mutants of tomato.Plant，9：173-182.

van Tuinen A，Cordonnier-Pratt M M，Pratt LH，Verkerk R，Zabel P，Koornneef M.1997.The mapping of phytochrome genes and photomorphogenicmutants of tomato.Theor Appl Genet，94：115-122.

Whitaker T W.1952.Genetic and chlorophyll studies of a yellow-green mutant in muskmelon.Plant Physiol，27：263-268.