香煙提取物和脂多糖對小鼠肺上皮細胞株MLE-12活性及水通道蛋白5 mRNA表達的影響

金常娥 甄國華 徐永健 劉 建 康冠楠 王樹娟

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是危害人類健康的常見病。引起COPD的一個重要原因為吸煙,吸煙可以激活支氣管上皮組織、巨噬細胞、中性粒細胞,導致它們分泌釋放蛋白酶和氧自由基等,從而破壞支氣管和肺泡。脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性細菌細胞壁的主要成分,為脂質(zhì)和多糖的復合物,被認為是微生物(細菌)感染后的強有力的炎癥始動因素,它可以直接引起呼吸道上皮損傷,導致慢性呼吸道炎癥。在香煙提取物(CSE)和 LPS兩者同時作用下,更多的細菌定植于呼吸道,持續(xù)的氣道炎癥導致氣道壁損傷和重構、粘液增生、膠原含量增加,最后引起氣流受限,促進COPD的發(fā)生和發(fā)展。這也可能就是COPD患者病情發(fā)生和發(fā)展的重要原因。本研究旨在觀察CSE和LPS刺激后小鼠肺上皮細胞MLE-12水通道蛋白5(AQP5)的表達,并初步評價其在COPD中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞:試驗所用細胞為小鼠肺上皮細胞株MLE-12(ATCC,美國)

1.1.2 主要試劑:DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司,美國);PrimeScriptTM RT reagent Kit、SYBR?Premix Ex TaqTM(TaKaRa 公司 ,日本);焦碳酸二乙酯(DEPC)(Amresco公司,美國);T rizol試劑(Invitrogen公司,美國);脂多糖(LPS)(Sigma公司,美國);香煙自購。

1.1.3 主要儀器:CO2培養(yǎng)箱(NUAIRE,美國);超凈工作臺(CX-102型,安徽蚌埠凈化設備廠);倒置相差顯微鏡、Rotor-Gene熒光實時定量 PCR儀(Corbett公司,澳大利亞)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠肺上皮細胞MLE12的培養(yǎng):小鼠肺上皮細胞MLE12生長于10%胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基中,在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng),每2～3天傳代一次,每次傳代比例為1:3～1:5。

1.2.2 香煙提取物(CSE)的制備:將市售某牌香煙(烤煙型,每支香煙焦油含量為17 mg,煙氣煙堿含量為112 mg)點燃,其過濾嘴端接一根橡皮管,橡皮管的另一端接注射器。點燃香煙,每次吸50ml,共收集12管600ml煙霧,將煙霧注入含25ml PBS的玻璃瓶中,搖晃玻璃瓶使煙霧溶入 PBS中,即為100%原液,實驗前用0.22μ m微孔濾膜過濾去除細菌和大顆粒。CSE均于使用前30min制備。CSE濃度用終容積中CSE原液的百分比表示。

1.2.3 CSE和LPS毒性試驗:CSE毒性試驗分為CSE組和CSE+LPS組,在貼壁生長于96孔板的小鼠肺上皮細胞株MLE-12細胞中,CSE組每孔加入200μ l含不同CSE濃度(2.5%、5%、10%、15%、20%)的含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液,CSE+LPS組每孔同時加入20μ g/ml的LPS和不同濃度的CSE(同CSE組)。LPS毒性試驗分為LPS組和LPS+CSE組,LPS組每孔加入不同濃度LPS(2.5μ g/ml、5μ g/ml、10μ g/ml、15μ g/ml、20μ g/ml),LPS+CSE組每孔同時加入10%CSE和不同濃度的LPS(同LPS組)。以上四組細胞每種濃度設3個復孔,并設不加CSE和LPS的空白對照孔,培養(yǎng)24h后每孔加入5mg/ml的四甲基偶氮唑鹽(MT T)20μ l,孵育 4h,1 500r/min 離心 10min,棄上清,每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150μ l,搖勻,用ELISA免疫酶標儀(570 nm)測定各孔培養(yǎng)液OD值。取各濃度平均OD值分別計算細胞活性。細胞活性(%)=(試驗孔OD值/對照孔OD值)×100%。

1.2.4 細胞分組和刺激試驗:刺激前一天,培養(yǎng)細胞用含0.02%EDTA的0.25%胰酶消化后,接種于6孔培養(yǎng)板上(接種密度為2.0×105cells/孔),細胞貼壁后進行刺激試驗。試驗分為四組(對照組、CSE組、LPS組、CSE+LPS組),后三組分別用 10%CSE 、20μ g/ml LPS 、10%CSE+20μ g/ml LPS,對照組用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。每組3孔,重復3次。

1.2.5 熒光實時定量PCR檢測AQP5mRNA的表達:上述各組細胞刺激培養(yǎng)24h后,用 Trizol一步法提取總RNA。紫外分光光度計測定RNA濃度,按照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄合成cDNA,20μ l體系加入1μ g總RNA。實時定量PCR按照說明書操作,反應體系為20μ l,分別加入雙蒸水7.2μ l、10μ M 的 上 下 游 引 物 各 0.4μ l、SYBR?Premix Ex TaqTM 10μ l。肌動蛋白 β-actin 為內(nèi)參照,并設陰性對照。反應條件相同,即預變性95℃,10s;兩步法PCR,即變性95℃,10s;延伸 60℃,20s;共40個循環(huán)。β-actin上游引物:5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′,下游引物 :5′-GACTCATCGTACTCCTGCT TGCTG-3′;AQP5 上游引物:5′-TTATCCATTGGCTTGTCGGTCA-3′、下游引物 5′-CACGATCGGTCCTACCCAGAA-3′。用雙標準曲線法求得目的基因mRNA的相對含量(以β-actin作為內(nèi)參照而求得相對含量)。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 CSE對肺上皮M LE-12細胞活性的影響

與不含 CSE的對照培養(yǎng)液相比較,肺上皮MLE-12細胞在CSE小于10%時的培養(yǎng)液中細胞活性無明顯降低(P＞0.05),當CSE濃度＞10%時各組細胞活性顯著降低(P＜0.01),下降約60%。相同CSE濃度下CSE組和 CSE+LPS(20μ g/ml)組之間的細胞活性無明顯差別(圖1)。而不同濃度的LPS刺激后細胞活性差異不大,LPS組和CSE+LPS組細胞活性均大于90%(圖2)。參考相關文獻和以上細胞毒性試驗結果,本文選用10%CSE和20μ g/ml的LPS作為后續(xù)試驗的刺激濃度。

圖1 CSE對肺上皮細胞活性的影響

圖2 LPS對肺上皮細胞活性的影響

2.2 CSE及LPS單獨或共刺激肺上皮細胞MLE-12后AQP5 mRNA水平的變化

對照組AQP5 mRNA表達量較高,相對含量為0.95±0.09,CSE組、LPS組AQP5 mRNA表達水平降低,其相對含量分別為0.70±0.13和0.57±0.20,CSE+LPS組AQP5表達水平進一步降低,為0.26±0.07。結果見圖3。

3 討 論

AQPs是一種跨膜水通道家族,廣泛表達于上皮和內(nèi)皮細胞膜上的選擇性高效轉運水分子的特異孔道[1],介導液體體積和滲透壓變化而引起細胞和生理反應。AQPs對于多種組織的正常分泌和吸收功能至關重要,包括眼睛、肺、唾液腺、汗腺、腎臟,并且在調(diào)節(jié)整個機體的水平衡中發(fā)揮重要作用。肺組織表達4種AQPs,其中AQP5高表達在遠端肺Ⅰ型肺泡上皮細胞,氣道上皮細胞輕微表達[2]。本研究發(fā)現(xiàn),AQP5在MLE-12上表達水平也很高。MLE-12本質(zhì)上是一種具有Ⅱ型肺泡上皮細胞特征的細胞系[3],由于Ⅱ型肺泡上皮細胞在維持肺泡屏障完整性及肺泡穩(wěn)定性方面起重要作用[4],可以合成肺泡表面活性物質(zhì),具有前體細胞功能,對于維持穩(wěn)定的正常肺細胞群起重要作用。研究[4]發(fā)現(xiàn)Ⅱ型肺泡上皮細胞含有豐富的Na+-K+ATP酶,具有將肺泡液中Na+主動轉運到肺間質(zhì)的能力,對于保持肺泡內(nèi)相對干燥,維持肺泡腔微循環(huán)具有重要作用。此外還有調(diào)節(jié)表面活性物質(zhì)代謝、離子轉運及損傷后肺組織修復等作用。Ⅱ型肺泡上皮細胞上表達的AQP5,可能參與了其水分子的轉運和代謝,從而影響Ⅱ型肺泡上皮細胞各種功能的發(fā)揮。

圖3 CSE與LPS單獨或共刺激MLE-12細胞后AQP5的mRNA水平變化

本研究結果顯示,單獨用CSE或LPS刺激MLE-12細胞,其AQP5表達水平下降,CSE與LPS共刺激后,AQP5表達水平進一步下降(低于單獨用CSE或LPS刺激組)。眾所周知,香煙和和呼吸道感染相互作用、相互促進,從而引起COPD的發(fā)生和發(fā)展,吸煙是引起COPD的主要因素,呼吸道感染被認為是COPD急性加重的主要原因。LPS是一種革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分,為脂質(zhì)和多糖的復合物,被認為是微生物的強有力的炎癥始動因素。研究顯示與COPD有關的一些致病因素如吸煙、促炎因子、細菌感染可以單獨誘導與COPD相關的一些病理變化如粘液分泌增加、持續(xù)的炎癥反應、氧化應激產(chǎn)物的增加等[5]。而在COPD病人,這些因素常常同時存在。我們的研究結果顯示CSE和LPS單獨刺激肺上皮細胞株MLE-12可以降低其AQP5的表達,而且CSE可以協(xié)同LPS進一步降低AQP5的表達。

研究認為AQP5在調(diào)節(jié)氣-血屏障的水通透性中發(fā)揮重要作用,并在調(diào)節(jié)氣道粘膜下腺體Muc5AC粘蛋白分泌中也發(fā)揮重要作用[6,7]。本研究表明,CSE協(xié)同LPS降低MLE-12細胞上AQP5的表達,可能會引起Muc5AC的合成和分泌增加、支氣管反應增強,從而參與COPD的發(fā)生和發(fā)展。研究表明,肺部炎癥性疾病(包括哮喘、COPD)常常以細胞因子表達增加、炎性細胞浸潤、過多水聚集或肺水腫為特征[8];小鼠肺炎模型研究表明AQPs的表達下降;對 AQP5基因敲除小鼠的研究發(fā)現(xiàn)AQP5在肺臟大部分水轉運中發(fā)揮重要作用[11]。CSE協(xié)同LPS降低M LE-12細胞上AQP5的表達可能有助于解釋吸煙和細菌雙重作用引起的肺部炎癥常常伴隨有肺水腫、肺順應性降低。