黃芩苷與鹽酸小檗堿在大鼠小腸吸收的相互作用研究Δ

杜青青，王戰國，劉芳，蔣學華（四川大學華西藥學院，成都市 610041）

口服給藥是中藥復方臨床應用最常用的給藥形式，吸收是中藥復方發揮臨床效應的前提。中藥有效成分之間的相互作用[1]已成為大家關注的焦點，而復方制劑腸吸收相互作用又與臨床療效密切相關。筆者以瀉心湯藥效成分黃芩苷、鹽酸小檗堿為研究對象，采用大鼠原位灌注模型進行其腸吸收相互作用初步研究[2]，以期為瀉心湯藥效成分配伍[3]體內藥動學相互作用研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-2010C HT型高效液相色譜（HPLC）儀（日本Shimadu公司）；Votex Genius 3型旋渦混合儀（德國IKA公司）；恒溫水浴鍋（上海醫療設備總廠）；Anke TGL-16C型臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.2 試藥

黃芩苷對照品（批號：110715-200514）、鹽酸小檗堿對照品（批號：110713-200609）由中國藥品生物制品檢定所提供；酚紅標準品（天津科密歐化學試劑開發中心，批號：20040111）；黃芩苷提取物（批號：060812，含量≥98%）、鹽酸小檗堿提取物（批號：060204，含量≥95%）由四川升和制藥有限公司提供；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.3 動物

SD大鼠，♂，體質量（200±20）g，購自四川大學實驗動物中心（動物合格證號：川實動管質第10號）。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 Kerbs-Ringer溶液（KR溶液，pH 7.4）：稱取NaCl 7.80 g、KCl 0.35 g、CaCl20.37 g、NaHCO31.37 g、NaH2PO40.32 g、MgCl20.02 g、葡萄糖1.40 g，加水定容至1 L。

2.1.2 酚紅KR溶液：取酚紅20.1 mg，精密稱定，KR溶液（含0.2%Vit C）稀釋定容至1 L。

2.1.3 空白腸循環灌注液：將KR溶液（含0.2%Vit C）照大鼠原位腸循環灌注法循環3 h，中止實驗，即得空白腸循環灌注液。

2.1.4 混合對照品溶液：取黃芩苷對照品10.24 mg、鹽酸小檗堿對照品11.80 mg和酚紅標準品5.00 mg，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，4℃貯藏，作為混合對照品溶液。

2.1.5 黃芩苷供試品溶液：分別取黃芩苷提取物31.42 mg、酚紅標準品20.1 mg，精密稱定，用KR溶液（含0.2%Vit C）稀釋定容至1 L。

2.1.6 鹽酸小檗堿供試品溶液：分別取鹽酸小檗堿提取物10.10 mg、酚紅標準品20.1 mg，精密稱定，用KR溶液（含0.2%Vit C）稀釋定容至1 L。

2.1.7 混合供試品溶液：分別取黃芩苷提取物31.5 mg、鹽酸小檗堿提取物10.02 mg、酚紅標準品20.10 mg，精密稱定，用KR溶液（含0.2%Vit C）稀釋定容至1 L。

2.2 大鼠小腸吸收實驗設計

選實驗前禁食12 h（自由飲水）的SD大鼠15只，隨機分成3組，分別用“2.1”項下“黃芩苷供試品溶液”、“鹽酸小檗堿供試品溶液”和“混合供試品溶液”進行實驗。將大鼠ip戊巴比妥鈉（40 mg·kg-1），麻醉后固定。沿腹中線打開腹腔（2～3 cm），結扎膽管，于十二指腸上部和回盲腸末端各切一小口，在上端小口處插入直徑為0.3 cm的玻璃管，并用線扎緊。用注射器將37℃的生理鹽水緩緩注入腸管，洗去腸管內容物至凈，然后在實驗腸管下端小口處插入玻璃管，并用線扎緊。將腸管兩端的玻璃管與蠕動泵的膠管連接，形成回路，開動蠕動泵。腸灌注液以5 mL·min-1流速循環10 min后，將流速調節為2.5 mL·min-1，立即自灌注液錐形瓶中取樣0.4 mL，同時向錐形瓶中補加酚紅KR溶液0.4 mL，其后每隔15 min亦按同法取樣并補加酚紅KR溶液，循環3 h后中止實驗。

2.3 樣品檢測

取循環樣品供試液0.4 mL，用甲醇0.8 mL稀釋，混旋1 min，15000 r·min-1離心5 min，取上清液10 μL進樣，記錄色譜圖，用回歸方程計算腸循環液中黃芩苷和鹽酸小檗堿的濃度。

2.4 統計學方法

采用SPSS 13.0中的Indepent-Samples t Test檢驗，考察黃芩苷、鹽酸小檗堿單獨給藥以及配伍后各組的吸收速率常數（ka）和吸收率（A）是否有統計學差異。

2.5 黃芩苷、鹽酸小檗堿和酚紅HPLC測定方法

2.5.1 色譜條件：色譜柱為Welchrom-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-水-磷酸-三乙胺（30∶70∶0.2∶0.1），柱溫為30℃，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為270 nm。

2.5.2 專屬性考察：分別取空白腸循環灌注液、混合對照品溶液、混合腸循環灌注液，按“2.5.1”項下色譜條件進樣10 μL，測定。結果表明，酚紅、黃芩苷和鹽酸小檗堿的保留時間分別為4.6、6.9和10.2 min；供試液中其它成分不干擾測定。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白腸循環灌注液；B.混合對照品溶液；C.混合供試品溶液；1.酚紅；2.黃芩苷；3.鹽酸小檗堿Fig 1 HPLC chromatogramA.blank circumfusion solution；B.circumfusion control；C.circumfusion sample；1.phenolsulfonphthalein；2.baicalin；3.berberine

2.5.3 線性關系考察：倍數稀釋法配制混合對照品系列標準工作液，按“2.5.1”項下色譜條件進樣10 μL。以峰面積積分值（A）為縱坐標，濃度（C）為橫坐標，進行線性回歸，得黃芩苷的回歸方程為A＝28243.76C－40.01（r＝0.9999），線性范圍為1.60～102.40 μg·mL-1；鹽酸小檗堿的回歸方程為 A＝41317.40C+2059.40（r＝0.9999），線性范圍為1.84～118.00 μg·mL-1；酚紅的回歸方程為A＝14424.71C－203.54（r＝0.9999），線性范圍為3.13～50.00 μg·mL-1。

2.5.4 精密度試驗：（1）分別吸取低、中、高濃度的混合對照品溶液，按“2.5.1”項下色譜條件進樣10 μL，根據回歸方程計算各溶液濃度。結果，高、中、低濃度黃芩苷、鹽酸小檗堿和酚紅日內RSD分別為0.13%、0.18%、0.22%；0.24%、0.22%、0.14%；0.80%、0.64%、0.93%。（2）分別在1、2、3 d吸取高、中、低濃度的混合對照品溶液，按“2.5.1”項下色譜條件進樣10 μL，根據回歸方程計算各樣品濃度，高、中、低濃度黃芩苷、鹽酸小檗堿和酚紅日間精密度分別為0.23%、0.12%、0.18%；0.19%、0.12%、0.17%；1.25%、1.11%、0.69%。結果表明，3個組分的日內、日間精密度均良好。

2.5.5 穩定性考察：黃芩苷、鹽酸小檗堿與酚紅在含有Vit C的KR溶液（37℃）中3 h內穩定，在甲醇處理后的樣品溶液中24 h內穩定。

2.5.6 回收率試驗：取不同體積混合對照品貯備液，置于10 mL容量瓶中，用空白KR液-甲醇（1∶2，V/V）稀釋至刻度，搖勻，得高、中、低濃度的對照品工作液。按“2.5.1”項下色譜條件進樣10 μL，測定，以測定濃度與加入濃度之比計算回收率。結果，高、中、低濃度黃芩苷回收率分別為（100.61±0.22）%、（99.49±0.18）%、（99.30±0.13）%；高、中、低濃度鹽酸小檗堿回收率分別為（99.68±0.14）%、（99.83±0.22）%、（100.84±0.24）%；高、中、低濃度酚紅回收率分別為（97.53±0.67）%、（98.17±1.08）%、（98.90±1.23）%。

2.6 黃芩苷與鹽酸小檗堿配伍前后大鼠小腸吸收動力學特征

黃芩苷在配伍鹽酸小檗堿前、后的ka具有顯著性差異（P＜0.05），但其A無顯著性差異；鹽酸小檗堿在配伍黃芩苷前、后的ka和A均有顯著性差異（P＜0.05）。黃芩苷與鹽酸小檗堿配伍研究中大鼠小腸吸收動力學特征見表1。

表1 黃芩苷與鹽酸小檗堿配伍研究中大鼠小腸吸收動力學特征（，n＝5）Tab 1 Absorptive kinetics characteristics of rats’small intestine in study of compatibility of baicalin and baicalein（，n＝5）

表1 黃芩苷與鹽酸小檗堿配伍研究中大鼠小腸吸收動力學特征（，n＝5）Tab 1 Absorptive kinetics characteristics of rats’small intestine in study of compatibility of baicalin and baicalein（，n＝5）

與配伍前黃芩苷組比較：＊P＜0.05；與配伍前鹽酸小檗堿組比較：#P＜0.05vs.baicalin perfused alone group：＊P＜0.05；vs.berberine perfused alone group：#P＜0.05

配伍前后配伍前A/%5.92±1.393.47±0.644.27±1.235.18±0.83#配伍后黃芩苷鹽酸小檗堿黃芩苷鹽酸小檗堿成分 參數ka/h-1 0.068±0.0020.044±0.0030.060±0.002＊0.057±0.006#

3 討論

研究結果表明，鹽酸小檗堿可以抑制黃芩苷的小腸降解或吸收；黃芩苷可以促進鹽酸小檗堿的小腸吸收。黃芩苷在吸收前有代謝與降解反應[4，5]發生，故不能將藥量減少計算出來的ka作為黃芩苷的小腸吸收常數，而應該是腸道代謝、降解和吸收的共同作用。此過程較為復雜，本研究只對其配伍之后產生的總體結果進行了分析，若要研究黃芩苷的腸道代謝、降解和吸收機制，還需要進一步研究。

研究中黃芩苷和鹽酸小檗堿配伍應用，黃芩苷的降解或吸收受到抑制，可能對其吸收和代謝均具有一定作用，此時黃芩苷在小腸中的停留時間增長，進入血液的量減少，對其藥效作用的發揮可能產生影響，推測黃芩苷在腸道內的存在時間延長與其藥效的發揮之間存在一定關系，這些有待進一步的科學實驗進行論證。研究證實，鹽酸小檗堿配伍黃芩苷后的吸收速率與量均發生變化，這可為瀉心湯藥效成分配伍吸收過程中的相互作用研究提供參考。

[1]肖春芬，周 莉，婁兆文.國內有關數種中藥有效成分間相互作用的研究現狀[J].中國藥房，2007，18（15）：32.

[2]劉太明，蔣學華，張梅娟，等.黃芩苷和黃芩素的大鼠在體腸吸收特性[J].中國藥學雜志，2006，41（23）：1784.

[3]魯佳慧，江 濱，曾元兒.中藥配伍的研究進展[J].時珍國醫國藥，2003，14（7）：419.

[4]Pieter B，Armorel DE.Comparative in vitro permeability of human vaginal，small intestinal and colonic mucosa[J].Int J Pharm，2003，261（1）：147.

[5]Parvin ZM，Mohammad BJ，Hosniyeh T，et al.Simultaneous determination of naproxen，ketoprofen and phenol red in samples from rat intestinal permeability studies：HPLC method development and validation[J].J Pharmaceut Biomed，2005，39（3）：624.