生姜醇提取物抗心肌缺血再灌注損傷的作用研究Δ

盧仁福，賈 科，侯朋遠，吳慶琛(重慶醫科大學附屬第一醫院胸心外科，重慶市 400016）

生姜為姜科植物姜Zingiber officinale Rosc的新鮮根莖，既是食品又是臨床廣泛應用的傳統中藥，其性味辛溫，具有解表散寒、溫中止嘔、行水解毒、化痰止咳之功效[1]。有關研究發現，生姜除具有抗血小板聚集、降低血脂和擴張血管、抗動脈粥樣硬化等作用外，還具有抗缺氧、抗氧化作用，對人心肌細胞缺氧缺糖性損傷有保護作用[2～3]。研究表明[4～6]，在家兔急性完全性腦缺血再灌注模型中，生姜提取液有抗急性腦缺血再灌注損傷作用。而生姜醇提取物在心臟缺血再灌注的研究，國內、外還未曾報道。本研究旨在探討生姜醇提取物對在體結扎大鼠抗急性局部心肌缺血再灌注損傷的作用及可能的作用機制，為生姜預處理在體外循環心臟手術中和冠心病急性心肌梗死有效恢復心肌血液灌注后心肌保護的臨床應用提供理論依據。

1 材料

1.1 儀器

DH-140型動物人工呼吸機（浙江醫科大學醫學儀器實驗廠）；3K30型高速冷凍離心機（Sigma公司）；DK-8D型電熱恒溫水箱（上海精宏實驗有限公司）；722型分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）；BL-420E型生物機能實驗系統（成都泰盟科技有限公司）；600型透射電鏡（日本日立公司）。

1.2 試藥

生姜醇提取物（西安天一生物技術有限公司，批號：TYG060326）；考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒、丙二醛（MDA）測定試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；其余試劑均為分析純。

1.3 動物

SD大鼠50只，鼠齡11周，♀，體質量250～300 g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供（動物許可證號：SCXK（渝）2007-0001）。

2 方法

2.1 模型的復制

大鼠稱重，ip 10%烏拉坦（6 mL·kg-1）麻醉后固定于手術臺。頸部去毛，切開皮膚，分離頸前肌，暴露氣管，氣管切開后插管（由一次性塑料滴管制作），接動物人工呼吸機行機械通氣（潮氣量40 mL·kg-1，吸氣∶呼氣＝1∶1.5），于呼氣末持續正壓通氣。雙前肢及右后肢接生物機能實驗系統記錄標準Ⅱ導聯心電圖，電腦全程實時記錄心電圖變化。胸骨旁行一0.7 cm切口開胸，暴露心臟，左心耳和肺動脈圓錐間找到與左冠狀動脈伴行的冠狀靜脈，在左心耳下方2 mm處以5～0無損傷縫合針穿線，進針深度為1.0～1.5 mm，寬度為2～3 mm，用一細小硅膠管墊于血管和結扎線之間結扎左冠狀動脈前降支，缺血再灌注方法及判斷標準按文獻[7]，即結扎后結扎線下方心肌顏色變紫紺、5～15 min心電圖顯示T波高聳或倒置為結扎成功；再灌注時松開結扎線，心肌顏色逐漸恢復紅潤為再灌注成功。

2.2 分組及給藥

將SD大鼠隨機分成5組，即假手術（等容生理鹽水）、模型（等容生理鹽水）及生姜醇提取物高、中、低劑量（400、300、200 mg·kg-1）組。ig給藥，每天1次，連續6周。最后一天ig后1 h開始復制模型，其中模型及生姜醇提取物高、中、低劑量組大鼠均行左冠狀動脈前降支結扎缺血30 min，再灌注90 min；假手術組只行左冠狀動脈前降支穿線，但不結扎。

2.3 指標的測定

再灌注實驗結束后迅速剪下心臟，生理鹽水反復沖洗血跡后剪下左室前壁梗死部位，固定位置一部分心肌做透射電鏡，余固定位置的一部分心肌置液氮貯藏。

2.3.1 心肌細胞超微結構檢查：心肌組織離體后1～2 min內，取左室前壁梗死部相同心肌部位4～5塊（組織大小1 mm3），放入3%戊二醛中固定，經脫水、包埋、超薄切片，染色后做透射電鏡檢查。

2.3.2 心肌組織勻漿MDA含量測定：準確稱取心肌組織，按質量體積比加9倍生理鹽水，在低溫冰水下用玻璃研磨器研磨制成10%心肌組織勻漿，離心，取上清液，用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量，用硫代巴比妥酸顯色法測定心肌組織勻漿MDA含量。

2.3.3 心肌組織勻漿SOD活性測定：準確稱取心肌組織，按質量體積比加99倍生理鹽水，制成1%心肌組織勻漿，離心，取上清液，用黃嘌呤氧化酶法測定心肌組織勻漿SOD活性。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 心肌細胞超微結構檢查

假手術組大鼠心肌細胞膜基本完整，線粒體膜基本完整；模型組大鼠心肌細胞破壞嚴重，呈壞死性改變，線粒體分布紊亂腫脹，膜破裂，Z線不清，排列紊亂、模糊不清，線粒體中重度溶解，甚至大片空泡化；生姜醇提取物高、中、低劑量組大鼠心肌損傷程度較模型組明顯改善，肌原纖維排列基本整齊規則，肌絲稀疏，少數線粒體輕度腫脹。透射電鏡下大鼠心肌細胞超微結構見圖1。

3.2 心肌組織勻漿MDA含量、SOD活性的測定

與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織MDA含量顯著升高（P＜0.01），SOD活性則顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，生姜醇提取物高、中、低劑量組大鼠心肌組織MDA含量顯著降低（P＜0.01），而SOD活性顯著升高（P＜0.01），隨著生姜醇提取物劑量增加，無劑量依賴現象。生姜醇提取物對大鼠心肌缺血再灌注后MDA含量、SOD活性的影響見表1。

圖1 透射電鏡下大鼠心肌細胞超微結構A.假手術組；B.模型組；C.生姜醇提取物低劑量組；D.生姜醇提取物中劑量組；E.生姜醇提取物高劑量組Fig 1 Ultrastructure of myocardial cells under TEMA.sham group；B.model group；C.low-dose ethanol extract of Z.officinale group；D.medium-dose ethanol extract of Z.officinale group；E.high-dose ethanol extract of Z.officinale group

表1 生姜醇提取物對模型大鼠心肌缺血再灌注后MDA含量、SOD活性的影響（，n＝10）Tab 1 Effects of ethanol extract of Z.officinale on the content of MDA and activity of SOD in myocardial ischemia-reperfusion rats（，n＝10）

表1 生姜醇提取物對模型大鼠心肌缺血再灌注后MDA含量、SOD活性的影響（，n＝10）Tab 1 Effects of ethanol extract of Z.officinale on the content of MDA and activity of SOD in myocardial ischemia-reperfusion rats（，n＝10）

與假手術組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.01vs.sham group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.01

4 討論

心肌缺血再灌注損傷發生機制尚未完全闡明，目前認為主要與氧自由基的產生、生物膜脂質過氧化、鈣超載等相關[8～13]。在正常情況下，氧自由基（OFR）可以被內源性自由基清除劑如SOD、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）等清除，使得細胞免受氧自由基的毒性損傷。心肌缺血再灌注后，機體主要通過黃嘌呤氧化酶途徑產生大量氧自由基，主要以羥自由基（OH-）的形式通過攻擊膜組分磷脂中的不飽和脂肪酸，引發一系列自由基鏈式反應，生成多種脂質過氧化物，并引起細胞內鈣超負荷，從而進一步導致細胞結構和功能的一系列損害。MDA作為脂質過氧化反應的產物，其含量不僅反映了脂質過氧化程度，也間接反映體內氧自由基的代謝狀況和機體細胞受自由基損害的程度[14]。SOD作為體內清除氧自由基重要的酶之一，其活性高低反映了清除氧自由基的能力。本研究中生姜醇提取物高、中、低劑量組大鼠心肌組織MDA含量顯著降低（P＜0.01），SOD活性顯著升高（P＜0.01），提示生姜醇提取物能降低心肌缺血再灌注損傷后的脂質過氧化程度，增強清除氧自由基能力，從而減輕心肌細胞結構和功能的損害，且隨著生姜醇劑量的增加，無劑量依賴關系。

心肌細胞超微結構改變是反映細胞損傷最直觀的指標[15]。線粒體是細胞清除氧自由基、進行呼吸作用和能量轉換的重要場所，其提供的能量是細胞生命活動的保證，其結構和功能的完整性是反映心肌損傷的敏感指標[16]。同時，線粒體是決定細胞損傷程度及顯示損傷能否可逆的關鍵細胞器，也是清除破壞力極大的氧自由基酶系統活力最重要的部位，具有維持活體細胞生化氧化和能量產生的重要功能。本研究中心肌細胞超微結構顯示，生姜醇提取物高、中、低劑量組心肌損傷程度較模型組顯著改善，線粒體破壞較小，說明生姜醇提取物可有效保護線粒體，從而增加清除氧自由基的場所和能量，增強清除氧自由基的能力，減輕脂質過氧化的程度，進而保護心肌細胞。

生姜醇提取物為生姜經乙醇提取后的主要物質，主要為姜辣素，可分為姜酚類、姜烯酚類、姜酮類、姜二酮類和姜二醇類等不同類型，具有散寒解表、溫中止吐、回陽通脈、燥濕消痰等功效。姜酚類、姜烯酚類、姜酮類、姜二酮類等業已證明有抗缺氧、抗清除自由基、抗脂質過氧化等多種藥理作用。研究表明[5，17]，生姜醇提取物在肝臟、腦的急性缺血再灌注損傷中具有保護作用。本研究中，生姜醇提取物降低了缺血再灌注后的脂質過氧化程度，增強了清除氧自由基的能力，心肌超微結構顯示生姜醇提物高、中、低組心肌細胞和線粒體破壞較小，減輕了缺血再灌注對心肌細胞及線粒體的損害，從而有效地保護了心肌細胞的結構和功能。本研究結果證實了生姜醇提取物在心肌缺血再灌注損傷中具有保護作用。其可能的作用機制是通過保護線粒體，增加清除氧自由基的場所和能量，增強清除氧自由基的能力，減輕脂質過氧化的程度，從而保護心肌細胞。

[1]黃泰康.常用中藥成分與藥理手冊[M].北京：中國醫藥科技出版社，1994：178.

[2]劉雪梅.生姜的藥理作用研究進展[J].中成藥，2002，24（7）：539.

[3]王 橋，宋學英，朱 瑩，等.生姜醇提取物抗氧化及抗缺氧作用的研究[J].中國中藥雜志，2003，28（6）：551.

[4]何麗婭，吳和平，黃崇新，等.生姜對腦缺血再灌注損傷防治作用的探討[J].現代應用藥學，1995，12（5）：3.

[5]何麗婭，吳和平，劉金雄，等.生姜對家兔實驗性腦缺血再灌注損傷的復蘇療效研究[J].實用中西醫結合雜志，1996，9（3）：155.

[6]何麗婭，黃崇新，李松平.生姜對缺血性腦損傷時過氧化氫酶、Ca2+-ATP酶活性及乳酸含量的影響[J].醫學理論與實踐，1999，12（1）：7.

[7]W olfrum S，Richardt G ，Dominiak P，et al.A pstatin a selective inhibitor of aminopeptidase P，reduces myocardial infarct size by a kinin-dependent pathway[J].Br J Pharmacol，2001，134（2）：370.

[8]Kim YM，Ha YM，Jin YC，et al.Palmatine from Coptidis rhizoma reduces ischemia-reperfusion-mediated acute myocardial injury in the rat[J].Food Chem Toxicol，2009，47（8）：2097.

[9]Ke ZP，Wang JN，Tang JM，et al.The role of PEP-1-SOD1fusion protein on ischemia-reperfusion injury in isolated perfused rat hearts[J].Zhonghua Xinxueguan Bing Zazhi，2009，37（3）：268.

[10]Koini EN，Papazafiri P，Vassilopoulos A，et al.5，7，8-Trimethyl-benzopyran and 5，7，8-trimethyl-1，4-benzoxazine aminoamide derivatives as novel antiarrhythmics against ischemia-reperfusion injury[J].J Med Chem，2009，52（8）：2328.

[11]Rao PR，Viswanath RK.Cardioprotective activity of silymarin in ischemia-reperfusion-induced myocardial infarction in albino rats[J].Exp Clin Cardiol，2009，12（4）：179.

[12]Kubavat JB，Asdaq SM.Role of Sida cordifolia L.leaves on biochemical and antioxidant profile during myocardial injury[J].J Ethnopharmaco，2009，124（1）：162.

[13]Parlakpinar H，Olmez E，Acet A，et al.Beneficial effects of apricot-feeding on myocardial ischemia-reperfusion injury in rats[J].Food Chem Toxicol，2009，47（4）：802.

[14]馬 云，肖 煒，侯連兵.腎衰寧分散片對慢性腎衰竭模型大鼠血清NO、NOS、SOD和MDA水平的影響研究[J].中國藥房，2008，19（24）：1853.

[15]武忠弼.超微病理學基礎[M].北京：人民衛生出版社，1990：113.

[16]Schneider R，Welt K，Aust W，et al.Cardiac ischemia and reperfusion in spontaneously diabetic rats with and without application of EGb 761：II.Interstitium and microvasculature[J].Histol Histopathol，2009，24（5）：587.

[17]鄧立明，彭成江，齊 波，等.生姜醇提取物對家兔肝臟缺血-再灌注損傷的保護作用[J].大理學院學報，2008，10（7）：10.