荔枝核提取物抑制乳腺增生模型大鼠乳腺組織ER和PR表達(dá)及促進(jìn)乳腺細(xì)胞凋亡作用研究Δ

林妮，呂俊華，潘競(jìng)鏘，肖柳英（1.廣州市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，廣州市 51010；.暨南大學(xué)藥學(xué)院藥理研究室，廣州市 5106；.廣州市中醫(yī)醫(yī)院/廣州市中醫(yī)中藥研究所藥理研究室，廣州市 51010）

乳腺增生病是婦女的一種常見(jiàn)病和多發(fā)病，發(fā)病年齡集中于20～50歲，50歲以后發(fā)病率急劇下降，其發(fā)病率占育齡婦女的40%左右，占全部乳房病的75%，是最常見(jiàn)的乳房疾病。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，乳腺增生病與內(nèi)分泌失調(diào)有關(guān)。

荔枝核含有氨基酸、多糖、總皂苷和黃酮類化合物等活性成分。大量的藥理實(shí)驗(yàn)和醫(yī)學(xué)臨床證實(shí)，荔枝核具有降血糖、調(diào)血脂、抗氧化作用[1，2]。近年研究表明[3]，荔枝核能抑制雌激素性乳腺增生病（HMG）大鼠乳腺組織增生，并調(diào)節(jié)病鼠性激素水平。本研究擬進(jìn)一步探討荔枝核對(duì)HMG大鼠乳腺組織雌二醇受體（ER）和孕酮受體（PR）表達(dá)及細(xì)胞凋亡的作用。

1 材料

1.1 儀器

CX41-32RFL型熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；－80℃冰箱（美國(guó)Thermo fora公司）；XSZ-D型倒置生物顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠）；低溫高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）；RM2135型切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；FACS 440型流式細(xì)胞儀（美國(guó)Becton dickinson公司）。

1.2 試藥

荔枝核提取物顆粒（廣東一方制藥有限公司，批號(hào)：0604229）；苯甲酸雌二醇注射液、黃體酮注射液（天津金耀氨基酸有限公司，批號(hào)分別為H20020529、H200205534）；乳結(jié)平（廣東彼迪藥業(yè)有限公司，批號(hào)：H44025162）；SABC免疫組化染色試劑盒（批號(hào)：SA1026）、DAB顯色試劑盒（批號(hào)：AR1022）、ER試劑盒（批號(hào)：BA0345）、PR試劑盒（批號(hào)：BA0107）均購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)SD未孕大鼠60只，♀，150～180 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物合格證號(hào)：SCXX（粵）2003-0002）。

2 方法與結(jié)果

2.1 模型的復(fù)制

[4]復(fù)制模型，im苯甲酸雌二醇（0.5 mg·kg-1）25 d后，改im黃體酮（4 mg·kg-1）5 d，即得。

2.2 分組及給藥

實(shí)驗(yàn)分為6組，即正常（蒸餾水）、模型（蒸餾水）、乳結(jié)平（3.3g·kg-1）及荔枝核高、中、低劑量（44 、22、11 g·kg-1）組，于復(fù)制模型第31天開(kāi)始ig給藥，連續(xù)給藥30 d。

2.3 乳頭形態(tài)學(xué)指標(biāo)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，連續(xù)觀察各組大鼠的一般狀況，未見(jiàn)大鼠進(jìn)食、飲水和體質(zhì)量改變。每周用游標(biāo)卡尺測(cè)量大鼠左側(cè)腋窩下第3對(duì)乳頭的直徑和高度1次。結(jié)果表明，復(fù)制模型后大鼠乳頭出現(xiàn)紅腫或增大，經(jīng)乳結(jié)平和荔枝核處理30 d后，病鼠乳頭紅腫或增生顯著減輕（P＜0.01）。荔枝核提取物對(duì)模型大鼠乳頭形態(tài)的影響見(jiàn)表1、表2。

表1 荔枝核提取物對(duì)模型大鼠乳頭直徑的影響（，n＝10）Tab 1 Effect of ESLon the diameter of nipples in HMG rats（，n＝10）

表1 荔枝核提取物對(duì)模型大鼠乳頭直徑的影響（，n＝10）Tab 1 Effect of ESLon the diameter of nipples in HMG rats（，n＝10）

與正常組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.mormal group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常組模型組乳結(jié)平組荔枝核高劑量組荔枝核中劑量組荔枝核低劑量組劑量/g·kg-1給藥后第3對(duì)乳頭直徑/mm給藥前乳頭直徑/mm 0.82±0.091.17±0.101.19±0.081.20±0.081.19±0.091.18±0.08--3.34422111周0.85±0.071.18±0.121.18±0.091.18±0.131.18±0.091.18±0.072周0.86±0.061.14±0.13＊1.09±0.08#1.08±0.111.09±0.121.08±0.173周0.88±0.061.16±0.11＊0.97±0.07##0.94±0.08##0.94±0.06##0.98±0.09##4周0.86±0.061.10±0.07＊0.92±0.08##0.90±0.08##0.91±0.06##0.96±0.08##

表2 荔枝核提取物對(duì)模型大鼠乳頭高度的影響（，n＝10）Tab 2 Effect of ESLon the height of nipples in HMG rats（，n＝10）

表2 荔枝核提取物對(duì)模型大鼠乳頭高度的影響（，n＝10）Tab 2 Effect of ESLon the height of nipples in HMG rats（，n＝10）

與正常組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.mormal group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常組模型組乳結(jié)平組荔枝核高劑量組荔枝核中劑量組荔枝核低劑量組給藥后第3對(duì)乳頭高度/mm劑量/g·kg-1--4周1.66±0.071.95±0.14＊1.65±0.08##1.70±0.06##1.66±0.16##1.68±0.10##3.3442211給藥前乳頭高度/mm 1.60±0.092.03±0.111.99±0.082.00±0.121.97±0.091.95±0.091周1.62±0.081.98±0.091.91±0.111.89±0.09#1.91±0.091.93±0.082周1.66±0.072.00±0.08＊1.80±0.08##1.82±0.07##1.80±0.06##1.85±0.073周1.68±0.091.97±0.12＊1.70±0.10##1.75±0.07##1.74±0.07##1.76±0.06##

2.4 乳腺組織ER和PR檢測(cè)[3]

末次給藥24 h后，按隨機(jī)數(shù)字表法從每組中隨機(jī)抽取6只大鼠，脫頸處死動(dòng)物，經(jīng)乳頭基底部最大切面取下大鼠右側(cè)第2對(duì)完整乳腺組織，用10%甲醛溶液固定，常規(guī)方法進(jìn)行石蠟包埋，石蠟切片脫蠟脫水；參照文獻(xiàn)[4，5]方法進(jìn)行免疫組化染色并觀察結(jié)果。ER和PR陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)為乳腺導(dǎo)管和小葉上皮細(xì)胞核著色。陽(yáng)性細(xì)胞率＜20%者為（-）；陽(yáng)性細(xì)胞率不足20%，但局部區(qū)域有少量較強(qiáng)著色的陽(yáng)性細(xì)胞者為（±）；陽(yáng)性細(xì)胞率＞20%者，按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)由少至多、著色由淺至深為+、++、+++、++++，并分別計(jì)1、2、3、4、5、6分，積分愈高表明ER和PR含量愈高。結(jié)果表明，模型組大鼠乳腺組織ER和PR表達(dá)顯著增強(qiáng)，與正常組大鼠比較有顯著差異（P＜0.01）；經(jīng)乳結(jié)平和荔枝核給藥各組處理后，乳腺組織ER和PR表達(dá)顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）。荔枝核提取物對(duì)模型大鼠乳腺組織ER和PR表達(dá)的影響見(jiàn)表3。

2.5 乳腺組織細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

取大鼠乳腺組織，于0.5 mL PBS液中剪碎，加入0.125%的胰酶消化液200μL，冰浴中消化5 min，加入含10%牛血清的DMEM培養(yǎng)基200μL停止消化。溶液過(guò)200目篩后4℃冷凍，1300 r·min-1離心 5 min，棄上清，細(xì)胞沉淀用 PBS液800～1000 r·min-1離心洗滌3次。收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為約每1 mL含1×106個(gè)，于預(yù)冷的70%乙醇中固定，4℃下貯藏；檢測(cè)前以1000 r·min-1離心5 min，棄上清后調(diào)整細(xì)胞數(shù)至每1 mL含1×106個(gè)，10 mg·L-1碘化丙啶室溫下染色30 min；尼龍網(wǎng)過(guò)濾，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，經(jīng)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)Cellquest軟件分析，繪制細(xì)胞數(shù)-DNA分布圖，計(jì)算凋亡細(xì)胞所占比例，用百分比表示。結(jié)果表明，正常、模型組大鼠乳腺組織出現(xiàn)的凋亡細(xì)胞較少，無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；荔枝核提取物高、中劑量組大鼠乳腺組織出現(xiàn)較高的凋亡細(xì)胞（P＜0.01或P＜0.05）；荔枝核提取物低劑量、乳結(jié)平組的凋亡細(xì)胞變化較小，無(wú)顯著差異（P＞0.05）。荔枝核提取物對(duì)模型大鼠乳腺組織細(xì)胞凋亡的影響見(jiàn)表4。

表3 荔枝核提取物對(duì)模型大鼠乳腺組織ER和PR表達(dá)的影響（，n＝6）Tab 3 Effect of ESL on the expression of ER and PR of mammary tissue in HMG rats（，n＝6）

表3 荔枝核提取物對(duì)模型大鼠乳腺組織ER和PR表達(dá)的影響（，n＝6）Tab 3 Effect of ESL on the expression of ER and PR of mammary tissue in HMG rats（，n＝6）

與正常組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.mormal group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常組模型組乳結(jié)平組荔枝核高劑量組荔枝核中劑量組荔枝核低劑量組PR 2.50±0.544.50±0.55＊2.67±0.51##3.00±0.63##3.17±0.75#3.50±0.84劑量/g·kg-1--3.3442211 ER 2.33±0.524.34±0.81＊2.83±0.75#2.67±0.82##3.16±0.75#3.67±0.81

表4 荔枝核提取物對(duì)模型大鼠乳腺組織細(xì)胞凋亡的影響（，n＝3）Tab 4 Effect of ESL on apoptosis of mammary glandular cells in H MG rats（，n＝3）

表4 荔枝核提取物對(duì)模型大鼠乳腺組織細(xì)胞凋亡的影響（，n＝3）Tab 4 Effect of ESL on apoptosis of mammary glandular cells in H MG rats（，n＝3）

與模型組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.model group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別正常組模型組乳結(jié)平組荔枝核高劑量組荔枝核中劑量組荔枝核低劑量組細(xì)胞凋亡率/%28.07±0.7632.33±0.9636.28±1.9556.49±3.35＊＊45.10±8.20＊37.34±0.79劑量/g·kg-1--3.3442211

2.6 子宮指數(shù)的計(jì)算

分別剖取大鼠的子宮稱重，與相應(yīng)大鼠的體質(zhì)量進(jìn)行換算，得出子宮指數(shù)。結(jié)果表明，與正常組比較，模型組大鼠子宮指數(shù)顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，荔枝核高、中劑量組大鼠子宮指數(shù)顯著降低（P＜0.05），而荔枝核低劑量組大鼠子宮指數(shù)也呈減小趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。荔枝核提取物對(duì)模型大鼠子宮指數(shù)的影響見(jiàn)表5。

表5 荔枝核提取物對(duì)模型大鼠子宮指數(shù)的影響（，n＝10）Tab 5 Effect of ESL on uterus index in HMG rats（，n＝10）

與正常組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.mormal group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常組模型組乳結(jié)平組荔枝核高劑量組荔枝核中劑量組荔枝核低劑量組子宮指數(shù)/g·100 g-1 0.24±0.400.52±0.12＊0.28±0.09##0.37±0.05#0.39±0.10#0.45±0.12劑量/g·kg-1--3.3442211

3 討論

隨著社會(huì)發(fā)展，社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)加大、心理壓力增加、膳食結(jié)構(gòu)不合理等因素使乳腺疾病發(fā)病率急劇增加。一直以來(lái)，HMG被認(rèn)為與患者內(nèi)分泌紊亂、雌激素水平過(guò)高及乳腺局部組織對(duì)雌激素過(guò)于敏感有關(guān)。

Strange等[4]證明，雌二醇（E2）和孕酮（P）水平在大鼠的性周期產(chǎn)生變化，并調(diào)節(jié)乳腺上皮的增殖與凋亡。研究[5]表明，胰島素生長(zhǎng)因子-1、表皮生長(zhǎng)因子和性激素通過(guò)mTOR通路調(diào)節(jié)乳腺上皮細(xì)胞的自噬作用，使乳腺上皮細(xì)胞的增殖與凋亡達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。ER和PR是一種蛋白質(zhì)，對(duì)E2和P具有高選擇性、高親和力并與其結(jié)合的生理功能特點(diǎn)。當(dāng)E2升高時(shí)，促使正常上皮細(xì)胞增殖，致使乳腺增生的發(fā)生；另一方面，抑制細(xì)胞免疫，使乳腺組織自身修復(fù)能力降低，增生的上皮細(xì)胞通過(guò)激素受體系統(tǒng)使ER合成增加，隨之代表ER活性的PR亦增多，隨著ER和PR合成的增多，E2進(jìn)一步刺激引起乳腺上皮細(xì)胞的增生和細(xì)胞功能活躍。性激素受體ER和PR的檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明了HMG與ER和PR的相關(guān)性，顯示乳腺良性病變中存在ER和PR，且表達(dá)較高。HMG隨著增生程度的加重，其ER和PR有顯著增加的趨勢(shì)。當(dāng)大鼠乳腺組織形態(tài)表現(xiàn)為顯著增生時(shí)，乳腺ER和PR病理積分也顯著升高。黃勤等[6]研究表明，雌激素受體顯著增多，對(duì)雌激素感受性增加，可導(dǎo)致HMG甚至癌變。

本研究結(jié)果表明，大鼠經(jīng)im苯甲酸雌二醇出現(xiàn)乳腺小葉、腺泡上皮增生、導(dǎo)管擴(kuò)張、間質(zhì)水腫等病理性改變；后期施用孕酮，進(jìn)一步促進(jìn)腺泡發(fā)育。說(shuō)明外源性性激素的異常刺激可造成大鼠乳腺組織的病理性增生，其改變與人體HMG病理類似，成功模擬HMG病理模型。對(duì)HMG大鼠乳腺組織ER和PR表達(dá)及細(xì)胞凋亡、子宮指數(shù)的觀察，與正常組比較，模型大鼠乳腺組織ER和PR表達(dá)顯著增強(qiáng)，乳腺組織出現(xiàn)的凋亡細(xì)胞較少，子宮指數(shù)顯著增高；荔枝核3個(gè)劑量組均可使模型大鼠乳腺組織ER和PR表達(dá)顯著降低，乳腺組織出現(xiàn)較高的凋亡細(xì)胞或死亡細(xì)胞，子宮指數(shù)顯著減少。由此推測(cè)，HMG的發(fā)病除了過(guò)高的E2直接刺激或P值降低不能保護(hù)乳腺組織的作用外，乳腺組織中ER和PR含量增加使組織對(duì)性激素的敏感性增強(qiáng)也是此病發(fā)生的另一重要因素。

HMG屬中醫(yī)“乳癖”、“乳痞”、“乳中結(jié)核”等范疇，臨床以乳房疼痛、腫塊隨月經(jīng)周期變化為主要特點(diǎn)。病因病機(jī)多與情志不調(diào)、肝氣郁結(jié)有關(guān)，在辨證分型上常分為肝郁氣滯、沖任失調(diào)、痰凝血瘀等型。荔枝核具有活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)等功效，在臨床上用于治療HMG取得良好的療效。本研究表明，荔枝核能不同程度地抑制乳腺組織ER和PR表達(dá)，并促進(jìn)乳腺組織細(xì)胞凋亡，改善HMG及子宮的病理變化，從而有效地抑制HMG，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌。

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