小檗堿對Toll樣受體2信號通路和炎癥因子的影響

李最瓊（南華大學附屬南華醫院，衡陽市 421002）

小檗堿（Ber）又名黃連素，是一種從黃連植物中提取的苯并異喹啉類季銨型生物堿[1]。Ber可作為一種廣譜抗菌藥物，對多種革蘭陰陽菌、真菌、霉菌、病毒、原蟲和線蟲等具有抑制殺滅的作用，已在臨床上應用多年，常用于治療感染性分泌性腹泄、消化性潰瘍及胃炎、霉菌感染和慢性膽囊炎等，其療效確切，但作用機制還不明確[2]。Toll樣受體2（TLR2）屬于模式識別受體，能識別多種病原微生物的成分，如革蘭陰性和陽性菌的肽聚糖、真菌的酵母聚糖、原蟲的黏蛋白和病毒的包膜糖蛋白等[3]。因此，以TLR2的細菌脂蛋白（BLP）刺激RAW264.7細胞，研究小檗堿對TLR2信號通路和炎癥因子表達情況的影響，不但完善了小檗堿抗菌消炎的機制，而且可為擴大其臨床應用范圍提供理論依據。

1 材料

1.1 儀器

680型酶標儀、PowerPac Basic電泳儀（美國Bio-Rad公司）；IX70型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；2300型CO2細胞培養箱（美國Sheldon公司）；SW-CJ-IF型潔凈工作臺（蘇州凈化設備廠）；Megafuge 1.0R型低溫離心機（德國Herculeus公司）；DNA/RNA測定儀（英國Pharmarcia公司）；GBox-HR DNA/蛋白質凝膠成像系統（英國Syngene公司）。

1.2 試藥

BLP（采用人工合成的細菌脂蛋白Pam3CSK4·3HCl，美國Alexis公司，批號：ALX-165-066-M002）；鹽酸小檗堿（美國Sigma公司，批號：D046）；抗β肌動蛋白單克隆抗體（Anti-beta-actin mAb）、抗核因子κB 抑制性蛋白（IκB）磷酸化抗體、羊抗鼠IgG、酶聯免疫吸附法（ELISA）干擾素-γ（IFN-γ）、干擾素-α（TNF-α）、白介素-10（IL-10）、白介素-13（IL-13）試劑盒（美國R&D公司）；Trizol試劑、DNA marker、預染蛋白marker（美國 Invitrogen公司）；TLR2、β-actin引物（上海捷瑞生物工程有限公司）；RT-PCR試劑盒（美國Fermentas公司）；Premix Taq（大連寶生物工程有限公司）；DMEM培養基低糖（干粉）、胎牛血清（美國Gibco-BRL公司）；其余試劑均為國產分析純。

1.3 細胞

RAW264.7細胞系購自中國典型培養物保藏中心。

2 方法

2.1 細胞培養

RAW264.7細胞用DMEM培養基培養至對數生長期，用含0.25%胰酶消化，20℃下125 r·min-1離心5 min，收集細胞，調整細胞密度為每1 L含4×108個，并接種于24孔細胞培養板，每孔定容1 mL，于37℃下5%CO2培養箱培養。

2.2 分組和處理

實驗分為3組，即對照、BLP、Ber（100 mol·L-1）+BLP組。對照組加 10 μL PBS；BLP 組加 10 μL BLP（終濃度 1 μg·mL-1）；Ber（100 μmol·L-1）+BLP 組先加 10 μL Ber（終濃度 100 μmol·L-1），孵育2 h后再加10 μL BLP（終濃度1 μg·mL-1），每一組均培養至6、12、24、48 h后收集細胞。

2.3 RT-PCR法檢測TLR2 mRNA表達

于對應的時間點（6、12、24、48 h）收集細胞，以Trizol試劑抽提RNA。測定RNA濃度后，取2 μg總RNA，按照試劑盒說明書加試劑，在20 μL體積下，用下列條件：65℃、5 min，65℃、42 min，70℃、5 min進行逆轉錄反應，接著進行聚合酶鏈反應。TLR2引物序列為：上游5′-GCGTTACATCTTGG AACTGTCGGA-3′，下游 5′-AGGAAGACCTTGCTGTTCTCTACTGT-3′；β-actin 引物序列為：上游5′-ATCATTGCTCCTCCTGAGCGCA-3′，下 游 5′-ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGA-3′。按照說明書加試劑，在20 μL體積下，用下列反應條件：94 ℃、3 min，94 ℃、40 s，55 ℃、40 s，72 ℃、1 min，72℃、10 min，30個循環進行聚合酶鏈反應。TLR2、β-actin的擴增產物分別為231、109 bp。經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠分析系統對擴增產物條帶進行掃描，并以TLR2灰度值/β-actin灰度值作為TLR2 mRNA的半定量值。

2.4 Westren-blot檢測IκB的磷酸化水平

于對應的時間點（6、12、24、48 h）收集細胞，PBS 洗2次，裂解液裂解，離心，收集上清液，即細胞總蛋白，用二喹啉甲酸（BCA）法定量測蛋白濃度，用等量蛋白和蛋白上樣緩沖液混合，煮沸，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），電泳后轉硝酸纖維素膜（NC膜），依次孵抗體，即抗磷酸化IκB抗體和辣根過氧化酶標志的羊抗鼠IgG，發光顯影定影后，用Quantity one分析軟件計算條帶灰度值。

2.5 ELISA檢測炎癥因子的表達

于對應的時間點（6、12、24、48 h）收集細胞培養上清，按照ELISA試劑盒說明書操作，具體的步驟如下：將50 μL稀釋液和50 μL 細胞培養上清分別加入包被有IFN-γ、TNF-α、IL-10和IL-13抗體的96孔板內，封板，室溫孵育2 h，吸出上清后將板拍干，洗板4次，再加100μL辣根過氧化酶偶聯的抗鼠IFN-γ、TNF－α、IL-10 和IL-13抗體，封板，室溫孵育2 h，徹底洗板4次，加入100 μL四甲基聯苯胺（TMB）底物，室溫避光孵育30 min，加入100 μL終止液終止反應，即刻讀取450 nm波長處吸光度。

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 Ber對TLR2 mRNA表達的影響

在BLP的刺激下，RAW264.7細胞顯著性高表達TLR2，并隨著刺激時間的延長而增高，具有時間依賴性；100 mol·L-1Ber在6、12 h促進BLP誘導的RAW264.7細胞表達TLR2，但在24、48 h抑制BLP誘導的RAW264.7細胞表達。Ber對TLR2 mRNA表達的影響見圖1。

圖1 Ber對TLR2 mRNA表達的影響1.對照組；2.BLP組；3.Ber+BLP組Fig 1 Effect of Ber on TLR2 mRNAexpression1.control group；2.BLP group；3.Ber+BLP group

3.2 Ber對IκB磷酸化水平的影響

在BLP的刺激下，RAW264.7細胞內IκB磷酸化水平顯著增高，并具有時間依賴性；100 μmol·L-1Ber在6、12 h 促進BLP誘導的IκB磷酸化，但在24、48 h抑制BLP誘導的IκB磷酸化。Ber對IκB磷酸化水平的影響見圖2。

圖2 Ber對IκB磷酸化水平的影響1.對照組；2.BLP組；3.Ber+BLP組Fig 2 Effect of Ber on the level of phosphorylation of IκB1.control group；2.BLP group；3.Ber+BLP group

3.3 Ber對炎癥因子表達的影響

在BLP的刺激下，RAW264.7細胞顯著性高表達IFN-γ和TNF-α（P＜0.01），而100 μmol·L-1Ber在 6、12 h 顯著促進IFN-γ和TNF-α表達，但在24、48 h 顯著抑制IFN－γ和TNF-α表達（P＜0.01或P＜0.05）；BLP的刺激不能顯著增加RAW 264.7細胞表達IL-10 和IL-13，但100 μmol·L-1Ber顯著增加BLP刺激的RAW264.7細胞表達IL-10和IL-13（P＜0.01或P＜0.05）。Ber對炎癥因子表達的影響見圖3。

4 討論

Toll樣受體（TLR）屬于模式識別受體，主要識別病原相關分子模式（PAMP），激活相應的信號通路，誘導炎癥因子的釋放，并激活獲得性免疫系統，最終清除侵入的病原微生物。

圖3 Ber對炎癥因子表達的影響A.IFN-γ；B.TNF-α；C.IL-10；D.IL-13；1.對照組；2.BLP組；3.Ber+BLP組；與對照組比較：＊P＜0.01；與BLP組比較：#P＜0.05，##P＜0.01Fig 3 Effect of Ber on the expression of inflammatory cytokinesA.IFN-γ；B.TNF-α；C.IL-10；D.IL-13；1.control group；2.BLP group；3.Ber+BLP group；vs.control group：＊P＜0.01；vs.BLP group：#P＜0.05，##P＜0.01

TLR2是TLRs家族中表達范圍最廣、識別病原微生物及其產物種類最多的分子，可以在細菌、病毒、真菌及其他一些病原體感染中發揮天然免疫作用，并通過其胞內信號轉導而激活獲得性免疫[4]。本研究用Ber作用于BLP刺激的RAW 264.7 細胞，RT-PCR 檢測的結果表明，100 μmol·L-1Ber在6 h和12 h能夠促進BLP刺激的RAW264.7細胞表達TLR2，但在24 h和48 h反而起到抑制的作用。這暗示著Ber可能具有雙向調節的作用。

核因子κB（NF-κB）是細胞內參與多種細胞反應的轉錄因子，如TLR2信號通路的傳導。NF-κB通過與抑制蛋白IκB的結合，以非活性的形式處在胞漿中。當IκB被蛋白激酶磷酸化并降解后，NF-κB釋放，轉移到細胞核內，并結合于特定的DNA位點，啟動相應基因的表達，如各種炎癥因子[5]。本研究中100 μmol·L-1Ber在6 h和12 h 促進BLP 誘導的IκB 磷酸化，但在24 h和48 h卻抑制BLP誘導的IκB磷酸化。結果表明，100 μmol·L-1Ber在早期（6 h和12 h）能夠促進BLP誘導的NF-κB激活，但晚期（24 h和48 h）卻起抑制的作用。

炎癥因子主要分為促炎細胞因子和抗炎細胞因子。促炎細胞因子主要包括IFN-γ和TNF-α等，其過度升高是過度炎癥反應的主要原因；抗炎細胞因子主要包括IL-10和IL-13等。研究表明，感染機體內促炎細胞因子的過度升高，可刺激機體分泌抗炎細胞因子，從而減輕炎癥反應，起到負反饋調節的作用[6，7]。本研究ELISA結果表明，100 μmol·L-1Ber在早期能夠促進IFN-γ和TNF-α的分泌，而晚期卻抑制IFN-γ和TNF-α的分泌，但在后期（12 h、24 h和48 h）顯著性促進抗炎因子IL-10和IL-13的分泌。這可能是過度促炎因子的分泌刺激了抗炎因子的表達，或者是Ber能促進抗炎因子的分泌。但BLP的刺激能誘導促炎因子IFN-γ和TNF-α的分泌，卻不能誘導抗炎因子IL-10和IL-13的分泌，表明IL-10和IL-13的分泌不是由負反饋調節誘導，而是由Ber促進的。

本研究表明，Ber在BLP刺激的早期，能夠促進TLR2的表達、NF-κB的激活和促炎因子IFN-γ和TNF-α的分泌，加強TLR2信號通路的激活，增強TLR2抗病原微生物的作用；但在BLP刺激的晚期，可能是過度炎癥反應時期，Ber反而抑制TLR2的表達、NF-κB的激活和促炎因子IFN-γ和TNF-α的分泌，抑制TLR2信號通路的激活，抑制過度炎癥反應。并且，Ber具有促進抗炎因子的分泌從而能抗菌消炎的作用，但其具體機制有待進一步的研究。

[1]葉寶娜，郝滿良，劉 萍，等.小檗堿的抗炎作用機制[J].中國獸醫雜志，2008，44（3）：85.

[2]鄭洪艷，徐為人.小檗堿藥理作用研究進展[J].中草藥，2004，35（6）：708.

[3]Trine H，Mogensen.Pathogen recognition and inflammatory signaling in innate immune defenses[J].Clinical Microbiolgy，2009，22（2）：2240.

[4]楊芳芳，陳成水.Toll樣受體2的研究進展[J].醫學綜述，2008，14（11）：1636.

[5]歐和生，廖端芳，唐朝樞.蛋白磷酸化對胞核因子κB活化的調節[J].中國動脈硬化雜志，1999，7（1）：80.

[6]于永洲，王占科，潘小清.可溶性白細胞分化抗原14對嚴重燙傷內毒素血癥小鼠血清促炎和抗炎細胞因子的影響[J].中國藥房，2009，20（4）：250.

[7]de Mello LM，Bechara MI，Solé D，et al.TH1/TH2 balance in concomitant immediate and delayed-type hypersensitivity diseases[J].Immunol Lett，2009，124（2）：88.