關龍膽乙醇提取物在急性肺損傷中的作用研究

馬忠偉,王秋玲，魏培玉（山東昌邑市人民醫院，昌邑市 261300）

急性肺損傷（ALI）是以肺血管內皮細胞及肺泡上皮細胞廣泛損傷為病理特征的一種嚴重的炎癥反應[1]。該病具有起病急、死亡率高的特點，流行病學調查顯示其病死率達35%～40%，是重癥監護室病患死亡的主要原因之一[2]。ALI發病機制復雜，其中過度失調的炎性反應被認為是最重要的因素之一，炎性介質與抗炎因子間的平衡決定了ALI的發展與轉歸。

關龍膽是龍膽科多年生草本植物，包括龍膽（Gentiana scabra B.）、三花龍膽（Gentiana triflora P.）及條葉龍膽（Gentiana manshurica K.），主產于我國東北和內蒙古。其味苦、性寒，具有瀉肝實火、清下焦濕熱的功效，主治黃疸、膽囊炎、高血壓、耳鳴等癥[3]。研究發現，關龍膽乙醇提取物能顯著抑制二甲苯和巴豆油引起的小鼠耳廓腫脹，減少冰醋酸致小鼠扭體次數[4]，提示關龍膽乙醇提取物具有較強的抗炎作用。關龍膽乙醇提取物能否有效改善ALI中的炎癥反應，目前尚未見相關報道。本研究擬采用ALI小鼠模型，初步探討關龍膽乙醇提取物在ALI炎癥反應中的作用。

1 材料

1.1 儀器

R-1002型旋轉蒸發器（上海申勝生物技術有限公司）；DZF系列真空干燥箱（上海華連醫療器械有限公司）；3K30型超低溫離心機（德國Sigma公司）；550型酶標儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 試藥

關龍膽（產地吉林，經山東昌邑市人民醫院中藥房鑒定為真品）；醋酸地塞米松片（天津天藥藥業股份有限公司，批號：0905016）；脂多糖（LPS，美國 Sigma公司）；前列腺素 E2（PGE2）、白介素-10（IL-10）酶聯免疫法（ELISA）試劑盒（美國Cayman公司）；環氧化酶-2（COX-2）ELISA檢測試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）。

1.3 動物

Ⅰ級純種NIH小鼠，♂，體質量24～28 g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供（動物合格證號：SCXK20020001）。

2 方法

2.1 關龍膽乙醇提取物的制備

稱取關龍膽700 g，切碎，用95%乙醇回流浸提3次（分別為3、2、2 h），合并濾液，減壓濃縮至無醇味，得浸膏，備用。

2.2 分組及給藥

實驗分為6組，即空白（等量生理鹽水）、模型（等量生理鹽水）、醋酸地塞米松（0.005 g·kg-1）及關龍膽乙醇提取物高、中、低劑量（10、5、2.5 g·kg-1）組。ig給藥，每天1次，連續5 d。。

2.3 ALI模型的復制[5，6]

ip 3%水合氯醛（0.3 g·kg-1）麻醉小鼠，頸部正中切口5 mm，分離氣管，微量注射器由氣管向肺方向滴注LPS溶液（2.5 mg·kg-1），1 min內滴注完畢，消毒縫合切口，小鼠保溫護理。

2.4 ELISA法檢測PGE2、IL-10、COX-2

ALI模型復制24 h后處死小鼠，眼球取血，l 500 r·min-1離心10 min，保留血漿于－80℃貯藏。按照ELISA試劑盒說明書測定血漿PGE2、IL-10、COX-2水平。

2.5 統計學方法

3 結果

3.1 關龍膽乙醇提取物對模型小鼠PGE2的影響

與空白組比較，模型組小鼠血漿PGE2水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，關龍膽乙醇提取物高、中、低劑量組小鼠血漿PGE2水平顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）。關龍膽乙醇提取物對模型小鼠血漿PGE2的影響見表1。

表1 關龍膽乙醇提取物對模型小鼠血漿PGE2的影響（，n＝8）Tab 1 Effect of ethanol extract of Radix et Rhizoma Gentianae on PGE2 in mic（e，n＝8）

表1 關龍膽乙醇提取物對模型小鼠血漿PGE2的影響（，n＝8）Tab 1 Effect of ethanol extract of Radix et Rhizoma Gentianae on PGE2 in mic（e，n＝8）

與空白組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.blank group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白組模型組醋酸地塞米松組關龍膽乙醇提取物低劑量組關龍膽乙醇提取物中劑量組關龍膽乙醇提取物高劑量組PGE2/pg·mL-1 744.24±21.301468.89±71.82＊1016.67±43.61#1158.92±39.08#1099.83±33.53#959.02±37.18##劑量/g·kg-1--0.0052.5510

3.2 關龍膽乙醇提取物對模型小鼠IL-10的影響

與空白組比較，模型組小鼠血漿IL-10水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，關龍膽乙醇提取物高、中、低劑量組小鼠血漿IL-10水平顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）。關龍膽乙醇提取物對模型小鼠血漿IL-10的影響見表2。

表2 關龍膽乙醇提取物對模型小鼠血漿IL-10的影響（，n＝8）Tab 2 Effect of ethanol extract of Radix et Rhizoma Gentianae on IL-10 in mic（e，n＝8）

表2 關龍膽乙醇提取物對模型小鼠血漿IL-10的影響（，n＝8）Tab 2 Effect of ethanol extract of Radix et Rhizoma Gentianae on IL-10 in mic（e，n＝8）

與空白組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.blank group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

IL-10/pg·mL-1 30.19±1.1799.35±8.98＊47.67±4.05#181.25±10.82#212.01±10.42#219.11±14.25##組別空白組模型組醋酸地塞米松組關龍膽乙醇提取物低劑量組關龍膽乙醇提取物中劑量組關龍膽乙醇提取物高劑量組劑量/g·kg-1--0.0052.5510

3.3 關龍膽乙醇提取物對模型小鼠COX-2的影響

與空白組比較，模型組小鼠血漿COX-2水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，關龍膽乙醇提取物高、中、低劑量組小鼠血漿COX-2水平顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）。關龍膽乙醇提取物對模型小鼠血漿COX-2的影響見表3。

4 討論

ALI是由心源性以外的多種致病因素導致的急性、進行性缺氧性呼吸衰竭，多由嚴重感染、創傷等原因引起，其病理表現以肺部炎性細胞、炎性介質浸潤和毛細血管通透性增加為主。LPS是細菌細胞壁的主要成分，是細菌內毒素的重要成分，也是導致ALI的常見因素。

表3 關龍膽乙醇提取物對模型小鼠血漿COX-2的影響（，n＝8）Tab 3 Effect of ethanol extract of Radix et Rhizoma Gentianae on COX-2 in mic（e，n＝8）

表3 關龍膽乙醇提取物對模型小鼠血漿COX-2的影響（，n＝8）Tab 3 Effect of ethanol extract of Radix et Rhizoma Gentianae on COX-2 in mic（e，n＝8）

與空白組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.blank group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白組模型組醋酸地塞米松組關龍膽乙醇提取物低劑量組關龍膽乙醇提取物中劑量組關龍膽乙醇提取物高劑量組COX-2/ng·mL-1 0.75±0.073.25±0.42＊1.77±0.65#2.11±0.29#1.62±0.31#1.27±0.28##劑量/g·kg-1--0.0052.5510

PGE2主要由COX催化花生四烯酸代謝生成，具有較強的擴張血管、增加血管壁通透性、促進炎性滲出的作用，是介導局部炎癥應答的主要介質之一，炎癥的發展與局部PGE2含量關系密切。COX-2為COX誘導型同工酶，易被各種因素誘導，是催化花生四烯酸生成PGE2的限速酶，其表達水平與炎癥反應中PGE2含量密切相關。抗炎因子IL-10主要是由單核/巨噬細胞、T細胞、B細胞產生，具有降低肺泡-毛細血管膜通透性、減少肺內巨噬細胞聚集的作用[7]。此外，研究表明IL-10對抗炎反應具有雙重調節作用：IL-10可抑制炎性介質IL-6和TNF-α，同時上調IL-1受體拮抗劑、可溶性腫瘤壞死因子受體等抗炎介質，使體內炎性介質/抗炎介質趨于平衡[8]。臨床資料也證實，ALI病死率與 IL-10 呈負相關[9]。PGE2、COX-2 和IL-10的變化可以反映機體內急性炎癥反應與抗炎介質的變化。因此，本研究測定了這些指標，用以評估關龍膽乙醇提取物在ALI炎癥反應中的作用。

研究結果表明，LPS氣管灌注可誘導COX-2表達增加，加速PGE2生成，促進ALI中炎癥的發展。關龍膽乙醇提取物可有效抑制COX-2的表達，減少PGE2生成，其效能與地塞米松相似。關龍膽乙醇提取物和地塞米松對血漿IL-10的作用則完全不同：關龍膽組血漿IL-10顯著高于模型組，地塞米松組則顯著低于模型組。這提示地塞米松作為一種免疫抑制劑在抑制促炎介質生成、發揮抗炎作用的同時，也抑制了合成抗炎介質的信號通路，在一定程度上對炎癥的繼續發展起到了推動作用。關龍膽乙醇提取物在有效抑制促炎介質生成的同時，對抗炎介質不僅無抑制作用，而且可誘導其大量生成，有利于損傷修復。

本研究通過動物實驗初步證實，關龍膽乙醇提取物可能通過誘導IL-10產生、抑制COX-2表達，進而抑制PGE2的生成等機制在脂多糖致ALI中發揮抗炎作用，這可望為ALI提供新的治療藥物。

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[5]裴凌鵬.蝦青素對脂多糖誘導小鼠急性肺損傷的保護作用[J].中國老年學雜志，2009，29（8）：937.

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