正交試驗優選清肝利膽膠囊醇提工藝

瀾蘭·艾則孜，帕依曼·亥米提，于寧（1.新疆醫科大學第一附屬醫院藥劑科，烏魯木齊市 830054；.新疆維吾爾自治區藥物研究所，烏魯木齊市 830004）

清肝利膽膠囊是以藏醫理論組方的現代藏藥復方制劑，處方來源于藏藥臨床經驗方，筆者已按中藥、天然藥物6（2）類完成了所有臨床前的研究工作，現進行臨床研究工作。本品處方由川西獐芽菜、波梭瓜子、唐古特烏頭、角茴香、兔耳草、苦買菜、訶子、甘草、大黃、金錢草、木香等12味藥材組成，具有祛濕除黃、清肝利膽和清熱解毒的功效。方中各藥分別被2005年版《中國藥典》（一部）、《部頒標準·藏藥分冊》和《藏藥標準》收載。由于處方中大黃含蒽醌類有效成分[1]，唐古特烏頭和角茴香含有生物堿[2]，兔耳草、苦買菜和川西獐芽菜含有黃酮和皂苷類[3～5]，這些有效成分均有祛濕除黃、清肝利膽和清熱解毒等藥理作用[1～5]，因此，根據各藥材有效部位和有效成分的理化性質，對這8味藥材選用乙醇提取。為將本方開發成可供臨床使用的工藝穩定、質量可靠的現代藏藥復方制劑，筆者特對該復方進行了醇提工藝研究，優選出了合理可行的提取工藝。

1 材料

1.1 儀器

Libror AEG-200型電子天平（日本島津公司）；SPD-10AVP型高效液相色譜（HPLC）儀，包括LC-10ATVP二元高壓泵、SPD-10AVP紫外檢測器、CTO-10ASVP柱溫箱、SCL-10AVP系統控制器（日本島津公司）；BS110S型電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；KQ-100DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DHG-9023A型恒溫箱（揚州三發電子有限公司）。

1.2 試藥

大黃素、大黃酚對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號分別為0756-200110、0796-200208）；甲醇為色譜純，HPLC用水為超純水，乙醇為藥用規格，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 大黃總蒽醌的含量測定[6～8]

2.1.1 色譜條件：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，色譜柱為Shimadzu VP-ODS柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液（85∶15），檢測波長為254 nm，柱溫為35℃，流速為1.00 mL·min-1。理論塔板數按大黃峰計算應＞3000。

2.1.2 對照品溶液的制備：稱取大黃素、大黃酚對照品各適量，用甲醇（色譜純）制成含大黃素4μg·mL-1和大黃酚8μg·mL-1的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備：稱取本品約1.0 g，置于100 mL錐形瓶中，加8%鹽酸20 mL，超聲處理5 min，再加三氯甲烷20 mL，加熱回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取2次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘渣加適量甲醇微熱使溶解，轉移至50 mL量瓶中，用少量甲醇分次洗滌容器，合并洗液至同一量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續濾液，即得。

2.1.4 陰性對照溶液的制備：稱取按處方比例除大黃以外的其它醇提藥材，按清肝利膽膠囊醇提制備工藝制成陰性樣品，按“2.1.3”項下方法制成陰性對照溶液。

圖1 高效液相色譜圖A.對照品；B.供試品；C.陰性對照；1.大黃素；2.大黃酚Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.test sample；C.negative control；1.emodin；2.chrysophanic acid

2.1.5 系統適用性試驗：取上述對照品、供試品、陰性對照溶液，照“2.1.1”項下色譜條件注入液相色譜儀。經計算，大黃素的理論塔板數 n＝5.54（tR/Wh/2）2＝12971，分離度 R＝2（tR2－tR1）/（W1+W2）＝1.65，拖尾因子fs＝W0.05h/2d1＝0.97；大黃酚的理論塔板數 n＝5.54（tR/Wh/2）2＝13103，分離度 R＝2（tR2－tR1）/（W1+W2）＝6.31，拖尾因子fs＝W0.05h/2d1＝0.96，均符合2005年版《中國藥典》的規定。在供試品的色譜圖中，對照品峰位與陰性對照沒有峰重疊，說明該法專屬性良好。色譜見圖1。2.1.6 線性關系考察：稱取大黃素、大黃酚對照品適量，加甲醇（色譜純）分別制成每1 mL含大黃素7.68μg和含大黃酚102μg的貯備溶液。分別精密量取上述大黃素對照品溶液2.5、5、7.5、10、12.5 mL，大黃酚對照品溶液0.5、1、2、3、4 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。分別精密吸取上述溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以進樣濃度（C，μg·mL-1）為橫坐標，峰面積積分值（A）為縱坐標，進行線性回歸，得大黃素回歸方程為A＝33319C+1536.1（r＝0.9996），大黃酚回歸方程為A＝39750C+22239（r＝0.9993）。結果表明，大黃素、大黃酚檢測濃度分別在0.768～3.84、2.04～16.32 μg·mL-1范圍內與各自峰面積積分值呈良好線性關系。

2.2 乙醇浸出物量的測定

精密量取乙醇提取液100 mL，置已干燥至恒重并稱重的蒸發皿中，水浴蒸發干，于105℃烘箱干燥3 h至恒重，取出，迅速置干燥器中冷卻，稱重，重復3次，求得乙醇浸出物量。

2.3 正丁醇萃取物量的測定

精密量取乙醇提取液200 mL，加正丁醇萃取3次，第1次30 mL，第2、3次分別為20 mL，全部置已干燥至恒重并稱重的蒸發皿中，水浴蒸發干，于105℃烘箱干燥3 h至恒重，取出，迅速置干燥器中冷卻，稱重，重復3次，求得正丁醇萃取物量。

2.4 三氯甲烷萃取物量的測定

精密量取乙醇提取液200 mL，加三氯甲烷萃取3次，第1次30 mL，第2、3次分別20 mL，全部置已干燥至恒重并稱重的蒸發皿中，水浴蒸發干，于105℃烘箱干燥3 h至恒重，取出，迅速置干燥器中冷卻，稱重，重復3次，求得三氯甲烷萃取物量。

2.5 正交試驗[9，10]

根據單因素和預試驗結果，固定提取次數，選擇乙醇濃度（A）、提取時間（B）和乙醇用量（C）為考察因素，采用正交試驗設計。結合常用分析方法和目前能夠得到有效成分對照品的情況，確定總蒽醌（即大黃素含量與大黃酚含量）、正丁醇萃取物量、三氯甲烷萃取物量和乙醇浸出物量為指標，綜合評分（權重系數分別為0.5、0.2、0.2、0.1），優選最佳乙醇提取工藝。因素水平見表1。

表1 因素水平Tab 1 Levels and factors

綜合評分＝（總蒽醌/最大總蒽醌）×50%+（正丁醇萃取物量/最大正丁醇萃取物量）×20%+（三氯甲烷浸出物量/最大三氯甲烷萃取物量）×20%+（乙醇浸出物量/最大乙醇浸出物量）×10%。

按處方比例稱取各味醇提藥材，濾液定容，分別測定大黃總蒽醌、正丁醇萃取物量、三氯甲烷萃取物量、乙醇浸出物量。正交試驗結果見表2。

由表2可知，各因素對綜合評分的影響大小順序為：A（乙醇濃度）＞B（提取時間）＞C（加醇量）；每個因素三個水平之間的趨勢為 A3＞A2＞A1，B2＞B3＞B1，C2＞C3＞C1；直觀分析得提取工藝為A3B2C2，即加8倍量80%乙醇回流提取2次，每次1.5 h。采用方差分析進一步優化，結果見表3。

由表3可知，A因素的影響具有顯著性（P＜0.05），B和C因素的影響均無顯著性（P＞0.05）。結合直觀分析結果，以A3B2C2組合為佳，即加8倍量80%乙醇提取2次，每次1.5 h。據此條件對川西獐芽菜、波梭瓜子等8味藥材進行驗證試驗，結果與正交試驗結果一致，說明篩選出的最佳醇提工藝可行、合理、穩定。

表2 正交試驗結果Tab 2 Results of orthogonal experiment

表3 方差分析結果Tab 3 Results of variance analysis

3 討論

本研究建立了以HPLC法測定清肝利膽膠囊中總蒽醌含量的方法，為進一步完善清肝利膽膠囊的質量控制標準提供了準確、簡便、可行的測定方法。

根據處方中甘草等其余藥材的藥理作用、有效成分和有效部位選定水提取法，選擇加水用量、提取次數和提取時間為因素進行正交試驗，最終確定最佳水提工藝為加8倍量水提取3次，每次1 h。按上述工藝進行重復試驗3批，測定每步工藝指標，證明本研究優選得的水提工藝合理、穩定、可行。故醇提工藝和水提工藝共同構成了清肝利膽膠囊的提取工藝。

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