山茱萸藥材及其制劑的LC-MS鑒別Δ

王 靜，陳隨清，王延麗，董誠明，馮衛(wèi)生（河南中醫(yī)學院，鄭州市 450008）

山茱萸是山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc.除去果核的干燥成熟果肉[1]，主產(chǎn)于我國河南、浙江、陜西等省，四川、安徽、山東省區(qū)亦有栽培[2]。其具有補益肝腎、澀精虛脫的功效，用于治療眩暈耳鳴、腰膝酸痛、陽痿遺精、遺尿尿頻、崩漏帶下、大汗虛脫、內(nèi)熱消渴等證。山茱萸為河南省道地藥材，同時作為常用中成藥（如六味地黃丸等）原料，在中藥生產(chǎn)及中醫(yī)臨床用量都很大，因此山茱萸藥材及其制劑的鑒別一直是研究者熱議的話題。有學者分別就其脂溶性和水溶性成分進行過指紋圖譜研究[3，4]，但因成分種類多，指紋圖譜比較復雜，難以解決藥材及其制劑鑒別的問題。本試驗利用山茱萸脂溶性成分高效液相色譜（HPLC）中熊果酸和齊墩果酸2個峰不易分離，但容易與其它成分分離的特點，通過熊果酸和齊墩果酸2個成分的三級質(zhì)譜（MS）圖，達到鑒別山茱萸藥材的目的；同時對含山茱萸的制劑——地黃丸系列進行了三級MS的分析，旨在為山茱萸藥材及其制劑的鑒別與質(zhì)量評價提供一定的依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

HPLC系統(tǒng)，包括真空脫氣機、低壓梯度混合四元泵、自動進樣器、PDA檢測器（美國Finnigen公司）；LCQ-Advantage MAX（離子阱）MS檢測系統(tǒng)（美國Finnigen公司）；HP-01型無油壓力真空泵（上海精科實業(yè)有限公司）；BS2242S型分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；SHZ-95B型循環(huán)水式多用真空泵（河南鞏義市英峪予化儀器廠）；RE-52A型旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮儀器廠）；SZ-93型自動雙重水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試藥

熊果酸（批號：110742-200516）、齊墩果酸（批號：110709-200304）對照品由中國藥品生物制品檢定所提供；10批山茱萸藥材購于鄭州市藥材公司，經(jīng)筆者鑒定為真品；六味地黃丸（批號：080671）、知柏地黃丸（批號：080503）、桂附地黃丸（批號：080103）、明目地黃丸（批號：071202）均由河南宛西制藥股份有限公司生產(chǎn)；甲醇為色譜純，水為雙蒸水，醋酸銨及乙酸乙酯均為分析純。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備

2.1.1 山茱萸藥材供試品溶液 精密稱取山茱萸藥材粉末（過3號篩）2.00 g，置于索氏提取器中，加乙酸乙酯100 mL，90℃索氏提取4 h。提取液用旋轉蒸發(fā)儀于30℃蒸干，加甲醇定容至10 mL，備用。

2.1.2 地黃丸系列供試品溶液 根據(jù)每個組方中山茱萸用量的比例，使山茱萸的量達到2.00 g，稱取相應的丸劑粉末，加乙酸乙酯100 mL，90℃索氏提取4 h。提取液用旋轉蒸發(fā)儀于30℃蒸干，加甲醇定容到10 mL，備用。

2.2 對照品溶液的制備

2.2.1 熊果酸對照品溶液 精密稱取熊果酸對照品0.00083 g，用甲醇定容至5 mL容量瓶中，備用（熊果酸濃度為0.166 mg·mL-1）。

2.2.2 齊墩果酸對照品溶液 精密稱取齊墩果酸對照品0.00096 g，用甲醇定容至5 mL容量瓶中，備用（齊墩果酸濃度為0.192 mg·mL-1）。

2.3 試驗條件

2.3.1 HPLC條件 色譜柱：Hypersil ODS C18（150 mm×2.1 mm，5 μm）；流動相：甲醇-10 mmol·L-1醋酸銨溶液（84∶16）；流速：0.2 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：210 nm；進樣量：5 μL。

2.3.2 MS條件 離子源：ESI，負離子掃描模式；鞘氣流速：1.5 L·min-1；輔氣流速：0.45 L·min-1；噴霧電壓：4.5 kV；高溫毛細管溫度：350℃；掃描范圍：110～600 amu。

2.4 結果

2.4.1 熊果酸和齊墩果酸對照品的三級MS圖 將濃度為10.24 μg·mL-1的熊果酸和10.375 μg·mL-1的齊墩果酸對照品溶液混合在一起進MS，得三級MS的主要碎片峰為m/z 377±1，391±1，408。齊墩果酸和熊果酸對照品混合后的三級MS圖見圖1。

圖1 齊墩果酸和熊果酸對照品混合后的三級MS圖Fig1 Three-level mass spectrometry of ursolic acid mixed with oleanolic acid

2.4.2 山茱萸藥材及地黃丸系列的HPLC圖 色譜見圖2。

圖2 高效液相色譜A.山茱萸藥材；B.六味地黃丸；C.知柏地黃丸；D.桂附地黃丸；E.明目地黃丸Fig 2 HPLC chromatogramA.C.officinalis；B.Liuwei dihuang pill；C.Zhibo dihuang pill；D.Guifu dihuang pill；E.Mingmu dihuang pill

2.4.3 山茱萸藥材的三級MS圖 10批山茱萸藥材的三級MS圖見圖3。

圖3 10批山茱萸藥材的三級MS圖（主要碎片峰為m/z 377±1，391±1，408）A～J.10批山茱萸藥材Fig 3 Three-level mass spectrometry for 10 batches of C.officinalis（the main fragment peak are m/z 377±1，391±1，408）A～J.10 batches of C.officinalis

2.4.4 含山茱萸的制劑的三級MS圖 含山茱萸的制劑的三級MS圖見圖4。

圖4 含山茱萸的制劑的三級MS圖（主要碎片峰為m/z 377±1，391±1，408）A.六味地黃丸；B.知柏地黃丸；C.桂附地黃丸；D.明目地黃丸Fig 4 Three-level mass spectrometry of C.officinalis preparation（the main fragment peak are m/z 377±1，391±1，408）A.Liuwei dihuang pill；B.Zhibai dihuang pill；C.Guifu dihuang pill；D.Mingmu dihuang pill

3 討論

液-質(zhì)（LC-MS）聯(lián)用技術是以HPLC為分離手段，以MS為鑒定方法的分析方法。與傳統(tǒng)檢測器相比，MS檢測器具有更豐富的信息，目前已得到越來越多的應用[5，6]。而LC-MS法已經(jīng)發(fā)展成為對復雜混合成分，尤其是非揮發(fā)性、極性和熱不穩(wěn)定性化合物進行高靈敏度定性、定量分析的常規(guī)手段。盡管如此，它仍受很多因素的限制。

本試驗所采用的是Finnigen電噴霧離子阱多級MS儀，離子源為ESI。ESI源要求流動相所添加的緩沖鹽pH調(diào)節(jié)劑應為揮發(fā)性，而HPLC常用的磷酸鹽、硼酸鹽等緩沖體系不能用于MS，應選用具揮發(fā)性的乙酸、甲酸、氨水、醋酸銨等替代。經(jīng)過摸索，本試驗采用醋酸銨為緩沖鹽；并且，按照MS要求，緩沖鹽的濃度未超過10 mmol·L-1。熊果酸和齊墩果酸為同分異構體，在眾多條件的限制下很難達到基線分離（如圖2所示），所以選擇將熊果酸和齊墩果酸同時進行MS分析。而且，熊果酸和齊墩果酸為酸性物質(zhì)，采用負離子掃描方式[7]在其通過色譜柱分離時，其在高壓狀態(tài)下與緩沖鹽醋酸銨發(fā)生絡合，減少了熊果酸和齊墩果酸的濃度，使離子化效率不太理想，故加大了進MS的熊果酸和齊墩果酸的濃度。

在上述試驗條件下，將熊果酸和齊墩果酸對照品混合溶液進MS，得三級MS的主要碎片峰為m/z 377±1，391±1，408。又對10批山茱萸藥材作三級MS分析，得主要碎片峰為m/z 377±1，391±1，408。再對含山茱萸的制劑進行三級MS測定，其中六味地黃丸和知柏地黃丸在上述色譜條件下，熊果酸和齊墩果酸與其它峰都有較好的分離度；桂附地黃丸和明目地黃丸中由于成分的相互作用致使其它峰與熊果酸和齊墩果酸的峰相互堆積，但可通過工作站設置對熊果酸和齊墩果酸的m-1峰m/z 456直接做三級MS，得其主要碎片峰為m/z 377±1，391±1，408，與山茱萸藥材的主要碎片峰相同。結果表明，本方法可以用于山茱萸藥材及其制劑的鑒別。

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學工業(yè)出版社，2005：19.

[2]陳隨清，董誠明，章運典，等.山茱萸栽培品種的調(diào)查[J].中藥材，2002，25（5）：305.

[3]韓志慧，趙玉叢，孟 騰，等.山茱萸脂溶性成分的高效液相色譜法指紋圖譜分析[J].鄭州大學學報（醫(yī)學版），2006，41（3）：476.

[4]何 娟，王學斌，盧 奎，等.山茱萸高效液相色譜指紋圖譜的研究[J].河南工業(yè)大學學報（自然科學版），2006，27（4）：32.

[5]王璐璐，方 蕓，葛衛(wèi)紅，等.LC-MS法測定人血漿中鹽酸偽麻黃堿的濃度[J].中國藥房，2007，18（32）：2510.

[6]金 輝，楊耀芳.LC-MS聯(lián)用法測定人血漿中硫辛酸的濃度[J].中國藥房，2007，18（35）：2755.

[7]趙新峰，孫毓慶.高效液相色譜-電噴霧-質(zhì)譜法分析山茱萸中的化學成分[J].中草藥，2008，39（2）：180.