巰甲丙脯酸生物黏附型緩釋膠囊大鼠體內藥動學研究Δ

宋益民，范鳴浩，張麗，張學成（.青島科技大學制藥工程系，青島市 6604；.中國海洋大學生命學院，青島市 66003）

目前臨床常用的治療高血壓和充血性心力衰竭的第1代血管緊張素Ⅰ轉化酶抑制劑是水溶性的巰甲丙脯酸（Captopril，Cap）的糖衣片或普通片[1，2]，由于Cap生物半衰期僅為1.9 h，需要日服3～4次，當其攝入總量達到37.5～75.0 mg時作用僅可維持6～8 h[3]；若單劑量口服50 mg，峰濃度可達600 μg·L－1以上[4]，而其治療濃度為50 μg·L－1。由于存在如此顯著的峰-谷差異，使得Cap普通制劑使用后易引起眩暈、頭疼、胃腸道紊亂等不良反應。此外，該藥在胃內偏酸的環境中穩定而在腸道內偏堿的環境中易分解，且胃及小腸上部為其主要吸收部位[5，6]。考慮到胃腸道生物黏附型制劑（Gastrointestinal bioadhesion drug delivery system，GBDDS）具有延長藥物在消化道釋放時間，在胃及小腸上部定位釋放藥物，從而改善藥物吸收，提高藥物的生物利用度的特性，筆者以殼聚糖、明膠為載體材料，羥乙基甲基纖維素為生物黏附材料，制備了Cap生物黏附型緩釋膠囊（Captopril bioadhesion sustained release capsules，CBSRCs）。研究結果表明，CBSRCs與Cap普通片相比具有良好的胃腸道黏附特性和明顯延緩Cap釋放作用[7]。在本文中，筆者進行了CBSRCs與市售Cap普通片在大鼠體內的藥動學行為的比較，以期為CBSRCs的臨床應用提供實驗依據和理論基礎。

1 材料

1.1 試藥

Cap生物黏附型緩釋膠囊（青島科技大學制藥工程系制備，規格：每粒30 mg）；Cap對照品（濰坊制藥有限公司，純度：99.5%）；Cap普通片（Captopril ordinary tablet，COT，青島國風集團黃海制藥有限責任公司，批號：020318，規格：每片25 mg）；對溴苯乙酰基溴（p-Bromophenacyl bromide，p-BPB，美國Sigma公司，純度：99%）；硫代水楊酸（Thiosalicyclic acid，TA，瑞士Fluka公司，純度：98%）；內標：對溴苯乙酸鄰羧基苯硫酸酯（TA-p-BPB，青島科技大學制藥工程系制備，純度98.5%）；乙腈為色譜級；乙二胺四乙酸（Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）等均為分析純。

1.2 動物

Wistar大鼠30只，♀♂各半，體質量（250±20）g，由青島市立醫院實驗動物中心提供（魯動質字20040627）。

1.3 儀器

LC-10Avp高效液相色譜（HPLC）系統，包括LC-6Ad高效輸液泵、SPD-10Avp紫外檢測器、SILvp-10ADvp全自動進樣器、CTO-10Avp柱溫箱、DGU-14A脫氣機、SCL-10Avp系統控制器、CLASS_VP5.01色譜工作站（日本島津公司）；WH-3型旋渦混合器（上海滬西分析儀器廠）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18（150 mm×4.4 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水-冰乙酸（45∶55∶0.2，V/V/V）；流速：1 mL·min－1；柱溫：20 ℃ ；檢測波長：258 nm，靈敏度：[Auxiliary：2；Range：1；Response：4]；進樣量：10 μL。

2.2 內標的制備

按文獻[8]方法并經改良，精密稱取TA 0.44 g，p-BPB 0.95 g，加入60 mL甲醇溶解，1 mol·L－1NaOH調節pH 至7.0，于72℃水浴回流1 h，蒸發至10 mL，磷酸鹽緩沖液（pH 7.0，60 mL）溶解，乙醚（60 mL）洗滌2次，水層加入1 mol·L－1HCl（8 mL），調節pH 至2.0，再用乙醚（60 mL）萃取2次，有機層合并，氮氣吹干，得透明油狀物即內標TA-p-BPB。

2.3 給藥及血樣采集

采用2組制劑單周期試驗設計方法。30只Wistar大鼠隨機分為2組，第1組先灌胃CBSRCs 0.1 g·kg－1（含Cap 5 mg·kg－1），第2組灌胃COT 0.02 g·kg－1（含Cap 5 mg·kg－1）。實驗前禁食12 h，灌胃給予CBSRCs或COT 2 h后投食，不限飲水，分別于給藥前和給藥后0.25、0.50、1.0、1.50、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12、16 h于眼眶后靜脈叢各采血約0.5 mL，肝素抗凝（125 IU，pH 7.0），加入0.1 mol·L－1抗壞血酸和0.1 mol·L－1EDTA各10 μL，以3000 r·min－1離心10 min，分離血漿。

2.4 血漿樣品的處理與測定

取血漿0.2 mL 加入 p-BPB（1 mg·mL－1）4 μL漩渦混合后，避光室溫放置30 min后，加入內標TA-p-BPB（1.6 mg·mL－1）溶液20 μL，震蕩30 s，室溫放置30 min，置于－24 ℃冷凍保存，待測。

取衍生化反應完成后的血漿，分別加入1 mol·L－1HCl溶液40 μL及乙酸乙酯0.6 mL震蕩2 min，離心10 min，分離出上層，加入0.1 mL稀碳酸鈉水溶液（飽和碳酸鈉與水的比例為1∶25，V/V），震蕩2 min，離心10 min，棄去上層，加入1 mol·L－1HCl溶液0.4 mL，乙酸乙酯0.6 mL，再震蕩2 min，離心10 min，分離出上層，于40℃水浴中氮氣吹干，殘留物用50 μL流動相溶解后進樣。

2.5 穩定性考察

Cap在血漿中不穩定，4℃下處理后的血漿樣品放置40 min后血漿中Cap含量即明顯下降，因此采集的血樣應立即離心分離出血漿，并加入衍生化試劑。解凍循環以及血漿樣品－20℃冷凍放置試驗顯示，血漿中衍生物在－20℃條件下，放置2 d內穩定，所以采血后應保存在－20℃條件，并應在2 d內測定。

2.6 HPLC方法驗證

2.6.1 血漿中Cap標準曲線的制備。取空白血漿0.2 mL，分別加入Cap 對照品，使其濃度分別為12.5、25、50、100、200、400、800 μg·L－1，然后加入4 μL p-BPB（1 mg·mL－1），按“2.4”項所述方法操作，每一濃度進行5樣本分析，進樣10 μL，記錄色譜，以樣品峰面積（As）與內標峰面積（Ai）的比值（Y）與Cap濃度（X）進行直線回歸，求得方程 Y＝0.0065X－0.0382（r＝0.9987，n＝5）。根據標準曲線，確定Cap血漿濃度測定的線性范圍為12.5～800 μg·L－1，最低檢測限為12.5 μg·L－1。

2.6.2 回收率和精密度試驗。取空白血漿3份分別加入Cap對照品，制備Cap 血漿使之濃度分別為 25、400 、800 μg·L－1，按“2.6.1”項下操作進樣測定，計算回收率結果見表1。

表1 回收率試驗結果（，n＝5）Tab 1 Results of recovery test（，n＝5）

表1 回收率試驗結果（，n＝5）Tab 1 Results of recovery test（，n＝5）

相對回收率/%101.68±2.5298.30±2.0498.21±2.01濃度/μg·L－1 25400800測定值/μg·L－1 25.42±0.63393.2±8.17785.68±16.08

結果，平均回收率為99.40%。

在同日內于不同時間按“2.6.1”項下操作進樣測定各7次，計算日內RSD；連續7d在同一時間測定每份樣品，計算日間RSD，結果見表2。

表2 精密度試驗結果（，n＝7）Tab 2 Results of precision test（，n＝7）

表2 精密度試驗結果（，n＝7）Tab 2 Results of precision test（，n＝7）

日間RSD/%8.603.462.46濃度/μg·L－1 25400800日內測定值/μg·L－1 25.80±1.79393.40±11.19797.62±16.99日內RSD/%6.942.852.13日間測定值/μg·L－1 25.20±2.17391.22±13.54795.54±19.63

2.6.3 干擾試驗。取大鼠空白血漿、空白血漿+Cap+內標和給予CBSRCs后血漿樣品+內標進樣分析，色譜結果見圖1。

由圖1可見，在選定的色譜條件下，Cap衍生物和內標分離效果良好，表明血漿中的內源物質對藥物測定無干擾。內標衍生物的保留時間為（5.88±0.43）min，Cap衍生物的保留時間為（3.67±0.05）min，且樣品峰與雜質峰的分離度大于1.5。

2.7 數據處理

所獲得實驗數據用DAS2.0藥動學軟件進行房室模型擬合，比較各房室模型的AIC值，按AIC最小值標準選擇最佳房室模型，計算出相應的藥動學參數，Cmax、tmax采用實測值，以非室模型統計矩計算AUC0～t、AUC0～∞、MRT，用配對比較t檢驗比較2種制劑的藥動學參數。

圖1 高效液相色譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+Cap+內標；C.給予CBSRCs后血漿樣品；1.Cap衍生物；2.內標衍生物Fig 1 HPLC chromatogramA.blank plasma；B.blank plasma+Cap+internal standard；C.plasma sample after rats given CBSRCs+internal standard；1.Cap derivate；2.internal standard derivate

2.8 藥動學結果

大鼠單劑量口服2種制劑后的血藥濃度-時間曲線詳見圖2；各數據經DAS2.0程序處理，符合二室模型，主要藥動學參數詳見表3。

圖2 2種制劑給藥后血藥濃度-時間變化情況Fig 2 Plasma concentration-time curve of two preparations

表3 2種制劑給藥后藥動學參數結果（，n＝15）Tab 3 The pharmacokinetic parameters of two preparations after medication（，n＝15）

表3 2種制劑給藥后藥動學參數結果（，n＝15）Tab 3 The pharmacokinetic parameters of two preparations after medication（，n＝15）

由表3可見，CBSRCs與COT 相比，t1/2β、AUC0～t、AUC0～∞、CL、Vd、tmax、Cmax差異具有顯著性（P＜0.05或P＜0.01）。

參數CBSRCsCOT t1/2α/h1.88±0.381.15±0.21 t1/2β/h3.76±0.752.87±0.59 tmax/h3.12±0.671.53±0.27 Cmax/μg·L－1722.97±133.681114.47±208.36 CL/L·h－12.87±0.513.43±0.67 Ka0.53±0.091.99±0.37 Vd/L10.98±1.9013.21±2.57 AUC0～t/μg·h·L－14856.03±835.464616.29±915.49 AUC0～∞/μg·h·L－15218.39±1037.584705.83±894.56 MRT0～t/h5.53±1.033.71±0.66 MRT0～∞/h6.63±1.214.02±0.76

3 討論

本文建立了HPLC-紫外檢測器法作為口服CBSRCs后檢測大鼠血液中Cap濃度的方法。由于Cap的化學結構中缺乏對紫外和可見光具特征吸收的基團，其本身的紫外吸收很弱，因此不能用HPLC-紫外檢測器直接檢測。而采用柱前衍生化使Cap與p-BPB生成具有較強紫外吸收的Cap-p-BPB后，可以明顯提高測定Cap的靈敏度。經驗證，該法具有良好的靈敏度和準確性，完全符合藥動學研究的要求，并與文獻[9]報道相一致。

本文采用隨機分組單劑量給藥的方案，測定了大鼠口服自制的CBSRCs和市售COT后的血藥濃度，并計算了t1/2α、t1/2β、tmax、Cmax、CL、Vd、AUC0～t、AUC0～∞、MRT0～t、MRT0～∞等主要藥動學參數。結果表明，CBSRCs與市售COT在大鼠體內的藥動學特征差異具有顯著性，CBSRCs的t1/2β、AUC0～t、AUC0～∞值明顯高于COT，CL、Vd均顯著低于COT，這與CBSRCs緩慢釋放藥物的性質有關，因而口服CBSRCs后在體內可維持較長時間有效血藥濃度。CBSRCs達峰時間滯后于COT近2 h，峰濃度僅為COT的64.79%；CBSRCs的Ka值顯著小于COT，體內MRT0～t、MRT0～∞顯著延長，說明CBSRCs明顯延長了制劑在大鼠體內的存在過程，具有較好的滯留和緩釋作用。

與市售COT相比，大鼠口服CBSRCs后，顯著改善了Cap原藥的藥動學性質，具有緩釋和長效的作用。

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