聚乳酸作為腦植入劑載體的安全性初步研究

唐華非，劉松青，李飛，馮華（1.第三軍醫大學西南醫院藥學部，重慶市 400038；.第三軍醫大學西南醫院神經外科，重慶市 400038）

由于血腦屏障的存在，多數藥物如化療藥、抗生素等以常規方式給藥后難以在腦內達到有效濃度，若加大給藥量又會增加全身性毒副作用。腦植入劑作為一種新型制劑，不僅可以使化療藥物避開血腦屏障，直接作用于腫瘤組織，減少全身性毒副作用，還具有緩控釋特性，在一定時間內使藥物能夠在病變部位維持在有效濃度。

聚乳酸（Poly-lactic acid，PLA）屬于脂肪族聚酯化合物，因其具有完全生物降解性和優良的生物相容性，在1997年被美國食品藥品管理局（FDA）批準作為藥用輔料，并廣泛地應用于藥物緩控釋系統。筆者曾以聚乳酸作為藥物緩釋載體自制羥基喜樹堿腦植入緩釋片，已完成緩釋片的處方優化[1]，并初步用于實驗動物惡性腦腫瘤的研究，取得了良好效果。腦組織具有其特殊性，尤其是腦神經元為高度分化的細胞，被損傷后不能再生。為了解聚乳酸對神經元和腦組織的影響，本文通過體外細胞培養和大鼠體內實驗觀察聚乳酸對神經元和腦組織的作用，綜合評價聚乳酸在腦內應用的生物安全性。

1 材料與方法

1.1 試藥、儀器與動物

聚乳酸（山東省醫療器械研究所，批號：060501，分子量：20000）；自制聚乳酸空白片（直徑3 mm，厚度2 mm，60Co照射滅菌后備用）；D-Hanks、DMEM/F12培養基（北京Hyclone公司）；胎牛血清、馬血清（美國Gibco公司）；N3培養基、細胞分裂抑制劑（北京軍事醫學科學院）；神經特異性烯醇化酶（NSE）單克隆抗體、3，3-二氨基聯苯胺（DAB）顯色試劑盒（北京中山生物技術有限公司）；細胞計數試劑盒（Cell counting kid-8，CCK-8，日本同仁化學研究所中國上海代表處）；Hoechst33258染液、抗熒光萃滅液、蘇木素-伊紅染液（Hematoxylin-Eosin，HE）、尼氏染液（Nissl）均由上海Beyotime公司提供。

激光共聚焦顯微鏡（德國Zeiss公司）；倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）。

成年SD大鼠18只，♂，體質量200～230 g；新生1 d的SD大鼠。生產合格證號：SCXK（軍）2002-007，由第三軍醫大學實驗動物中心提供。

1.2 體外試驗方法

1.2.1 孔板預處理。聚乳酸組孔板采用溶劑揮發成膜法[2]進行處理，即將定量的聚乳酸溶解在二氯甲烷和丙酮的混合溶劑中（體積比為9∶1），然后倒入鋪有聚四氟乙烯薄膜的孔板中，待溶劑揮發完全后，加入異丙醇浸潤，脫膜后，干燥至恒重，60Co（2.0 Mrad）照射滅菌[3]，小牛皮膠包被，隔夜使用。正常對照組孔板僅用小牛皮膠包被。

1.2.2 大腦皮層神經元原代培養[4]。將新生1 d的SD大鼠用75%的乙醇浸泡消毒后，采用無菌方法迅速斷頭，取大腦，用D-Hanks液清洗并剔除腦膜和血管，將分離得到的大腦皮質剪成約1 mm3大小的組織塊，用0.125%胰蛋白酶37℃消化30 min。經200目篩網過濾，離心（800 r·min－1，5 min）后棄去上清，加入含馬血清培養基制成細胞懸液。計數后按每毫升106個接種于預處理的96孔培養板或24孔培養板中，置于37℃、5%CO2孵箱內培養。48 h后全量換N3培養基[5]（DMEM/F12培養基+2%N3），并加入細胞分離抑制劑（5-氟-2’-脫氧尿苷15 μg·mL－1和尿苷35 μg·mL－1），作用48 h后更換新鮮培養液。以后每3 d半量更換培養液1次。

1.2.3 神經元純度鑒定。神經元體外原代培養至第7天，進行NSE染色鑒定。神經元可被NSE特異性識別并表現為彌漫性胞漿染色。隨機計數500個細胞，計算NSE陽性細胞染色率。方法步驟參照試劑盒說明書。

1.2.4 倒置相差顯微鏡觀察。體外原代培養的大腦皮層神經元生長周期較長，分別在不同時間點觀察聚乳酸組和正常對照組細胞的生長情況。

1.2.5 細胞毒性測定。分別在體外培養神經元至第7、9、12天時利用CCK-8[6]檢測聚乳酸對神經元的影響。該試劑中含有WST-8，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內的一些脫氫酶還原生成橙黃色的formazan，細胞毒性越大，則顏色越淺。

將神經細胞分別接種于預處理的96孔板中，每個處理組設6個復孔，并設不含細胞的空白對照孔。每孔加CCK-8試劑10 μL，37℃孵育2 h后，在酶標儀上采用雙波長進行測定，檢測波長490 nm，參比波長550 nm。

1.2.6 檢測聚乳酸對細胞凋亡的影響。分別將體外培養至第7、9、12天的神經元用4%多聚甲醛4℃固定5 min，蒸餾水充分漂洗后，加Hoechst33258工作液染色10 min。蒸餾水漂洗后，用濾紙吸去殘留的液體，滴加少許抗熒光萃滅劑和封片劑于載玻片上，將蓋玻片的細胞面朝下進行封片，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。隨機選擇不同視野，至少計數500個細胞，細胞的凋亡情況用百分率表示。

1.3 體內實驗方法

1.3.1 大鼠分組。將SD大鼠隨機分為3組，分別為聚乳酸空白片組、假手術組和正常對照組，每組6只。

1.3.2 模型制作。采用3%戊巴比妥鈉40 mg·kg－1腹腔注射進行麻醉，立體定向儀固定大鼠頭部，無菌開顱，以冠狀縫前3 mm，矢狀縫右側3.5 mm為中心，開直徑為3 mm的骨窗[7]，切開硬膜，取60Co照射滅菌的聚乳酸空白片植入皮層下1 mm，縫合。假手術組采用同樣方法開顱，模擬聚乳酸空白片機械損傷，剪去一定大小的皮質后，縫合。正常對照組不作任何處理。

1.3.3 大鼠術后觀察。在術后不同時間點對大鼠各項指標進行觀察檢測，包括飲食、行為、體質量變化等，進而對大鼠受損和恢復程度進行評價分析。

1.3.4 標本取樣及檢測。植入緩釋片后30 d，分別對大鼠實施麻醉，4%多聚甲醛全身灌注，取大腦，去除緩釋片殘片，生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分，10%福爾馬林溶液固定保存。HE染色后觀察神經元和膠質細胞的數量和分布，對大腦正常組織和病變組織的形態結構進行比較。Nissl染色后觀察神經元尼氏體受染情況，在生理情況下，尼氏體大而數量多，反映神經細胞合成蛋白質的功能較強，在神經元受損時，尼氏體的數量可減少甚至消失。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 神經元純度鑒定結果

體外原代培養至第7天的神經細胞，經NSE染色，胞漿和突起被染成棕褐色而胞核未被染色的為陽性細胞，整個細胞都未被染色的為陰性細胞。采用該方法體外培養大腦皮層神經元純度經鑒定達95%以上。

2.2 倒置相差顯微鏡觀察結果

神經元接種6～12 h后開始貼壁，并有集合現象，種植12 h后，大部分細胞貼壁呈圓形，其中少數神經細胞開始伸出1～2個突起。培養24 h后，伸出突起的神經細胞逐漸增多，突起一般長為20～40 μm。7 d后神經元胞體大，飽滿，直徑8～12 μ m，有立體感，軸突細長均勻，直徑恒定，樹突長而多，呈網格狀。2組細胞形態見圖1。

圖1 2組神經元的生長情況（×200）a.正常對照組；b.聚乳酸組Fig 1 The growth of neurons in 2 groups（×200）a.normal control group；b.PLAgroup

圖1顯示，體外原代培養皮層神經元9 d后，2組神經元胞體均比較飽滿，周圍有光暈，生長狀態良好。

2.3 聚乳酸對體外培養大腦皮層神經元毒性的影響

以CCK-8吸光度值為指標測得聚乳酸對體外培養的大腦皮層神經元毒性的影響見表1。

表1 2組不同時間點神經元的CCK-8吸光度值（）Tab 1 The CCK-8 absorbance of neurons in 2 groups at different time points（）

表1 2組不同時間點神經元的CCK-8吸光度值（）Tab 1 The CCK-8 absorbance of neurons in 2 groups at different time points（）

12 d 0.356±0.0070.368±0.012組別聚乳酸組正常對照組7 d 0.364±0.0140.381±0.0119 d 0.363±0.0130.375±0.020

表1顯示，各時間點2組兩兩比較，正常對照組CCK-8吸光度值均略高于聚乳酸組，但經統計學分析沒有顯著性差異（P＞0.05）。

2.4 聚乳酸對體外培養大腦皮層神經元凋亡的影響

聚乳酸對體外培養的大腦皮層神經元凋亡的影響見表2。表2顯示，隨時間的延長，2組神經元凋亡率均有所增加；各時間點2組兩兩比較，聚乳酸組致神經元凋亡率略高于正常對照組，但經統計學分析沒有顯著性差異（P＞0.05）。

表2 2組不同時間點神經元凋亡率（%，）Tab 2 Apoptosis rates of neurons in 2 groups at different time points（%，）

表2 2組不同時間點神經元凋亡率（%，）Tab 2 Apoptosis rates of neurons in 2 groups at different time points（%，）

組別聚乳酸組正常對照組12 d 4.59±0.954.50±0.987 d 3.68±2.423.64±2.219 d 4.25±2.293.88±2.86

2.5 大鼠行為能力觀察結果

術后各組大鼠活動量均減少，食物和水的消耗量降低；1 d后能正常飲食，聚乳酸空白片組較假手術組警覺性降低。在術后3 d內聚乳酸空白片組體質量下降較多，5 d后各組大鼠行為能力差異不明顯，實驗期間各組大鼠均未發生非處死性死亡。

2.6 聚乳酸空白片對大鼠腦組織的影響

各組腦組織HE染色和Nissl染色結果見圖2（A點指示假手術所致腦損傷；B點指示聚乳酸空白片所致腦組織缺損，箭頭指示小膠質細胞增生）、圖3（圖f中箭頭指示尼氏染色的神經元）。

圖2 各組腦組織HE染色（×200）c.正常對照組；d.假手術組；e.聚乳酸空白片組Fig 2 Brain tissue stained by HE in each group（×200）c.normal control group；d.sham-operated group；e.PLAblank tablet group

圖2為30 d后大鼠腦組織HE染色結果。與假手術組比較，聚乳酸空白片組大鼠受損腦組織處出現小膠質細胞增生，但神經元數量和形態沒有明顯變化。圖3為30 d后大鼠腦組織的Nissl染色結果。腦組織神經元的尼氏體著藍色，胞核淡染。與假手術組比較，聚乳酸空白片組大鼠腦組織神經元尼氏體的數量仍維持在較高水平，差異不明顯。

上述各實驗結果表明，本實驗采用的原代細胞培養方法可以得到純度較高、活性較好、生長穩定的大腦皮層神經元；聚乳酸對體外培養的大鼠大腦皮層神經元抑制作用和誘導凋亡作用均不明顯；聚乳酸植入腦部后，腦組織有一定的炎癥反應，但神經元的數量和活性未受顯著影響。

3 討論

神經元是高等動物神經系統的結構單位和功能單位。隨著腦內靶向治療技術的開發和應用，越來越多的緩控釋材料被應用于腦腫瘤的治療。作為腦植入緩釋制劑的載體，除了要具有良好的生物降解性，更重要的是對神經元的生長和功能影響要小。本實驗首次對聚乳酸和大腦皮層神經元進行了共培養，證實了聚乳酸與體外培養的大腦皮層神經元可以長期共存，神經元經聚乳酸誘導后凋亡不明顯。

在神經元體外培養過程中，前期主要是對神經元的純化過程，神經元也會發生部分自然死亡，7 d后存活下來的細胞數量才趨于穩定。為減少實驗誤差，檢測神經元活性一般選擇在培養至7～9 d后進行。

聚乳酸空白片植入腦內后，腦組織有輕微的的炎癥反應，且略強于假手術組，其原因除機械損傷外，可能與聚乳酸代謝過程中產生的部分碎片有關[8]。尼氏染色結果顯示神經元的數量和蛋白合成能力受影響程度不明顯，與文獻[7]對聚己內酯（PCL）和聚乳酸乙醇酸共聚物（PLGA）生物相容性研究結果相符，聚乳酸對腦組織的損傷不明顯。對高分子材料的體內降解研究[9]表明，PLGA被植入體內4周時，74%以上已被降解代謝，而聚乳酸的降解要更快些，所以動物體內實驗選擇30 d作為觀察時間點。

本研究通過體外和體內實驗觀察聚乳酸對神經元和腦組織的影響，初步證實聚乳酸對體外培養的大腦皮層神經元抑制作用和誘導凋亡作用均不顯著，對腦內神經組織無明顯毒性。

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