衍生化分光光度法快速測定卡托普利片中主藥的含量Δ

熊正平，黃開順，朱鏈鏈，陳志瓊

（重慶醫科大學藥物分析教研室，重慶市 400016）

卡托普利（Captopril，Cap），化學名為 1-（（2S）-2-甲基-3-巰基-1-氧代丙基）-L-脯氨酸，是第1代血管緊張素轉化酶（ACE）抑制劑藥物，對各種類型高血壓均有明顯的降壓作用，特別是對其它降壓藥物治療無效的嚴重高血壓有很好的療效，是臨床上廣泛應用的高血壓藥物，因此建立其制劑中主藥含量的簡便快速的測定方法具有重要的意義。但是卡托普利中含有不穩定的巰基，所以對其測定有一定難度。現階段的測定方法研究很多都集中在將巰基衍生化后再進行卡托普利的含量測定，如采用對溴苯甲酰甲基溴（p-BPB）[1，2]、5，5′-二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB）[3]、2，2′-二硫二吡啶（2-PDS）[4]等衍生化試劑，但它們的衍生化產物都不太穩定，給測定帶來不便。本文在比較多種衍生化試劑后，采用2，4-二硝基氟苯（DNFB）[5]作為衍生化試劑，結果其與卡托普利反應后形成的產物很穩定，再采用簡便的分光光度法即可對其含量進行準確測定，結果可靠。

1 儀器與試藥

UV-2102PCS型紫外可見分光光度計（尤尼柯上海儀器公司）；HS-2D超聲波清洗器（上海新芝生物技術研究所）；旋渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；Elgastat UHO超純水器（英國Elga公司）。

卡托普利對照品（重慶醫科大學藥物化學教研室提供，批號：20080104，純度：99.9%）；卡托普利片（湖北華中藥業有限公司，批號：20080504、20080703、20080903，規格：每片25 mg）；DNFB、二甲基亞砜（DMSO）均為化學純，乙腈為特級純，氫氧化鈉、甲醇、乙酸乙酯及其它試劑均為國產分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 卡托普利貯備液。精密稱取卡托普利對照品25 mg，置于25 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，使制備成濃度為1 g·L－1的貯備液。

2.1.2 衍生化試劑。DNFB經減壓蒸餾后用乙腈配成0.05%的溶液，避光保存。

2.1.3 NaOH溶液的制備。稱取NaOH 1 g置于250 mL的容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，使成0.1 mol·L－1的貯備液，然后再稀釋成0.01 mol·L－1的溶液。

2.1.4 供試品溶液的制備。取卡托普利片20片，精密稱定，研細。精取適量（約相當于卡托普利25 mg）置于25 mL容量瓶中，加水超聲使其溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，過濾，得續濾液。精密量取續濾液50 μL和DNFB 90 μL置于10 mL的試管中，再加入25 μL NaOH溶液和5 μL DMSO，旋渦1 min后放入40℃水浴，暗處反應45 min后用水稀釋到5 mL刻度處，搖勻，即得。

2.2 吸收光譜的制備

量取1 g·L－1的卡托普利對照品50 μL和DNFB 90 μL置于10 mL的試管中，再加入25 μL NaOH溶液和5 μL DMSO，然后將其旋渦1 min后放入40℃水浴中暗處反應45 min，再用水稀釋到5 mL刻度處，搖勻。以空白試劑為參比，在200～500 nm波長范圍內掃描，同樣掃描得到卡托普利對照品、DNFB、供試品和空白輔料溶液（取不含卡托普利的片劑處方中其它輔料，按“2.1”項下“供試品溶液的制備”方法制備）的吸收光譜見圖1。

圖1 紫外吸收光譜1.DNFB；2.卡托普利對照品；3.衍生反應產物；4.空白輔料Fig 1 UV absorption spectrum1.2，4-dinitrofluorobenzene；2.captopril control；3.product of derivatization reaction；4.blank excipients

從圖1可知，卡托普利對照品在202 nm波長處有最大紫外吸收（曲線2），但是在紫外末端，不宜用于主藥的含量測定；而用DNFB（曲線1）衍生后使其吸收峰波長增至（342±1）nm（曲線3），且衍生產物穩定，有利于測定卡托普利片的主藥含量。同法處理卡托普利片供試品溶液和輔料，結果表明片劑中卡托普利的衍生化產物與對照品產物的吸收光譜一致；片劑輔料不與DNFB發生反應，且在（342±1）nm波長處無吸收（曲線4），將不會干擾卡托普利的測定。因此，本研究以342 nm為測定波長。

2.3 試驗條件的考察

2.3.1 反應溫度對衍生化反應的影響考察。精密量取1 g·L－1的卡托普利對照品50 μL和DNFB 50 μL置于10 mL的試管中，再加入25 μL NaOH溶液和5 μL DMSO，然后將其旋渦1 min后分別在室溫、40℃、60℃和80℃水浴暗處反應45 min后，用水稀釋至5 mL刻度處，搖勻，以空白試劑為參比，在342 nm波長處測定吸光度，結果分別是0.211、0.330、0.328、0.339，可見溫度會對衍生化反應產生影響，較低的溫度不利于反應的發生，升溫可以提高反應產率，但是溫度超過40℃后反應產率變化不大，所以選擇40℃水浴為反應溫度。

2.3.2 反應時間的考察。反應其他條件同“2.3.1”，旋渦1 min后放入40℃水浴暗處反應，反應時間分別是15、30、45、60、90、150 min，在342 nm波長處測定的吸光度分別是0.299、0.329、0.332、0.334、0.326、0.326，即反應進行45 min基本達到平衡，故本試驗選取45 min為反應時間。

2.3.3 DNFB的用量考察。反應其他條件同“2.3.1”，改變衍生化試劑DNFB溶液的用量，分別加入DNFB 0、50、65、75、85、90、95、100、110 μL，在40 ℃水浴暗處反應45 min后在342 nm波長處測定其吸光度，分別為 0、0.325、0.397、0.412、0.420、0.424、0.416、0.410、0.415。結果表明，卡托普利與DNFB的反應是一個可逆反應，稍過量的DNFB有利于衍生化產物的形成，但是過量太多反而會使衍生產物量減少，所以DNFB選取量為90 μL。

2.3.4 NaOH溶液的用量考察。反應其他條件同“2.3.1”，改變NaOH溶液用量，分別加入NaOH溶液0、10、20、25、30、35、40 μL，在40℃水浴暗處反應45 min后在342 nm波長處測定其吸光度，結果如圖2所示。

圖2 NaOH溶液的用量對反應的影響Fig 2 Effect of the amount of NaOH solution on derivatization reaction

由圖2可以看出，當NaOH溶液加到20 μL后吸光度變化不大，所以本試驗NaOH溶液選用25 μL。

2.3.5 衍生物的穩定性考察。反應其他條件同“2.3.1”，在40℃水浴暗處反應45 min后用水稀釋至5 mL時及室溫放置20、40、60、90、150 min、24 h后測定吸光度。其結果分別為0.421、0.421、0.420、0.420、0.420、0.420、0.420。可見吸光度在24 h內沒有明顯變化，所以在室溫狀況下，衍生化反應產物在24 h內都可以穩定存在，使測定更為方便。

2.4 標準曲線的制備

取7支試管，分別精密量取1 g·L－1的卡托普利對照品0、5、20、30、40、50、70 μL和DNFB 90 μL，其他操作照“2.1.4”項下“于10 mL的試管中”起，同法操作，以空白試劑為參比，在342 nm波長處測定吸光度，以吸光度（A）對卡托普利的質量濃度（ρ）進行回歸分析，得回歸方程ρ＝25.153A－0.0916（r＝0.9999），結果表明卡托普利檢測濃度在1.0～14.0 μg·mL－1的范圍內有良好的線性關系。

2.5 方法的重復性

取同一樣品5份，按“2.1.4”項下供試品溶液的方法操作，間隔不同時間測定吸光度，考察日內精密度，結果RSD＝0.24%（n＝5）；取同一樣品于1周內不同日測定吸光度考察日間精密度，結果RSD＝1.37%（n＝5），表明方法的重復性很好。

2.6 回收率試驗

分別精密稱取卡托普利對照品適量置于25 mL容量瓶中，分別加入處方量的各種輔料，按“2.1.4”項下供試品溶液的方法操作，低、中、高3個濃度（每個濃度平行測定3份）下回收率計算結果如表1。

表1 回收率的測定結果Tab 1 Results of recovery tests

2.7 卡托普利片中主藥含量測定

選取3個批次的市售卡托普利片，照“2.1.4”項下供試品溶液的方法操作，每個批次平行測定3次，計算其主藥標示含量，并與《中國藥典》的碘酸鉀法[6]進行比較，結果如表2。

3 討論

表2 卡托普利片中主藥含量測定結果Tab 2 Content determination of the main component of Captopril tablets

《中國藥典》中[6]采用碘酸鉀法測定卡托普利片劑主藥含量時，由于其輔料大部分都是淀粉，過濾時不能全部過濾干凈或淀粉部分溶于水中使滴定終點提前到達，因此使測定結果很不準確。經驗證，采用DNFB作為衍生化試劑與卡托普利反應，使吸收峰波長增至342 nm，且形成的衍生產物很穩定，能更方便地測定卡托普利片劑中主藥的含量。本試驗結果表明，本方法穩定、可靠，且操作簡便、快速，適用于卡托普利片劑中主藥的含量測定。

[1]張群艷，李章萬，洪 諍，等.衍生化HPLC柱切換法測定人血漿中卡托普利濃度的方法研究[J].藥物分析雜志，2001，21（4）：273.

[2]Huang TM，He Z，Yang B，et al.Simultaneous determination of captopril and hydrochlorothiazide in human plasma by reverse-phase HPLC from linear gradient elution[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2006，41（2）：644.

[3]劉 魁，戎欣玉.衍生化分光光度法測定卡托普利片的含量[J].華西藥學雜志，2004，19（1）：64.

[4]萬紹暉，郝海歐，萬紹宇.卡托普利緩釋片衍生化紫外分光光度法[J].河南大學學報（醫學科學版），2001，20（3）：15.

[5]Archontaki HA，Koupparis MA，Efstathiou CE.Semi-automated kinetic determination of phenolic compounds using a fluoride-selective electrode and based on their micellar-catalysed with 1-fluoro-2，4-dinitrobenzene[J].Analyst，1989，114：591.

[6]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（二部）[S].2005年版.北京：化學工業出版社，2005：105.