RP-HPLC法測定施普睿達原料藥中主藥的含量Δ

徐 陽，劉培勛，禹 潔，王育苗，龍 偉，馬世堂

（中國醫學科學院北京協和醫學院，放射醫學研究所，天津分子核醫學重點實驗室，天津市 300192）

豆科槐屬植物體內含有為數不少的具有生物活性的生物堿，其中部分生物堿具有一定的抗腫瘤作用[1]。施普睿達是豆科槐屬植物生物堿經半合成得到的抗腫瘤生物堿衍生物。建立其質量標準并進行方法的驗證是進行抗腫瘤藥效學研究的保證。經過反復驗證，筆者建立了用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法測定施普睿達含量的有關方法。該方法系統適用性好、簡便、準確可靠、重復性好，適合施普睿達的含量測定。

1 儀器與試藥

Alliance 2695 HPLC儀，包括Empower工作站、PDA 2998檢測器（美國Waters公司）；AUY220電子分析天平（日本島津公司）；PB-10pH儀（德國Sartorius公司）。

施普睿達對照品（批號：2009224，用3種不同流動相、經面積歸一化法測定，純度均大于99.0%；并經3種不同展開劑薄層色譜結果鑒定）和供試樣品施普睿達原料藥（批號：2009316、2009319、2009409；面積歸一化法測定純度分別為99.0%、95.2%、97.5%）均為本所自制；乙腈為色譜純，其它試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：SunFireTMRP C18（500 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：磷酸鹽緩沖溶液（pH＝3.01）∶乙腈＝9∶1；流速：1 mL·min－1；檢測波長：220 nm；進樣量：10 μL；柱溫：25 ℃；在上述色譜條件下，按施普睿達峰面積計算理論塔板數不低于5000。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液制備。精密稱取施普睿達對照品25 mg，置于25 mL棕色容量瓶內，加流動相制成濃度為1 mg·mL－1的對照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液制備。精密稱取施普睿達供試品25 mg，置于25 mL棕色容量瓶內，加流動相制成濃度為1 mg·mL－1的供試品溶液，備用。

2.3 方法專屬性的考察[2]

2.3.1 施普瑞達與起始原料以及中間產物的分離。精密稱取施普瑞達對照品5 mg、原料槐定堿5 mg同置于10 mL容量瓶中，用流動相定容。進樣10 μL，記錄保留時間。精密稱取施普瑞達對照品5 mg、中間產物奧賽博思5 mg同置于10 mL容量瓶中，用流動相定容。分別進樣10 μL，記錄保留時間。結果見圖1。

由圖1可見，各化合物均能有效分離。

圖1 高效液相色譜圖A.施普瑞達對照品；B.供試品；C.施普瑞達+槐定堿；D.施普瑞達+奧賽博思；1.施普瑞達；2.槐定堿；3.奧賽博思Fig 1 HPLC chromatogramA.Sprida control；B.test sample；C.Sprida spiked with sophoridine；D.Sprida spiked with aosaibos；1.Sprida；2.sophoridine；3.aosaibos

2.3.2 降解試驗。稱取4 mg施普睿達供試品，置于10 mL容量瓶內，放置在170℃的干燥箱內，5 h后，加入10 mL流動相溶解，作為高溫破壞溶液；稱取4 mg施普睿達供試品置于10 mL容量瓶內，分別滴加35%的濃鹽酸3滴靜置2.5 h，或滴加6 mol·L－1的NaOH溶液3滴靜置1.5 h，或滴加30%雙氧水5滴加熱1 h，之后各樣品加入流動相稀釋至刻度，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液進樣，作為酸、堿、氧化破壞溶液。稱取4 mg施普睿達供試品置于10 mL透明容量瓶，在光照（4500±500）Lx下放置20 d后，加入流動相稀釋至刻度，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，作為光破壞溶液。取上述5種溶液進樣分析，結果表明，各種條件下降解產物與施普瑞達分離度良好。各溶液色譜見圖2。

圖2 施普瑞達降解產物高效液相色譜圖A.高溫破壞溶液；B.酸破壞溶液；C.堿破壞溶液；D.氧化破壞溶液；E.光破壞溶液；1.施普瑞達Fig 2 HPLC chromatogram of degradation products of SpridaA.treated with high temperature；B.treated with acid；C.treated with alkali；D.treated with oxidation；E.treated with light；1.Sprida

2.4 線性范圍

精密量取對照品溶液5.0、2.0、1.0、0.5、0.1、0.1 mL分別置于10、10、10、10、10、25 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，得一系列對照品溶液。在“2.1”項色譜條件下測定，記錄色譜。以施普睿達濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程：Y＝4×106X+1756.8（R2＝0.9999）。結果表明，施普睿達檢測濃度線性范圍為0.004～0.5 mg·mL－1。

2.5 最低檢測限

取對照品溶液適量加流動相稀釋成一定濃度的溶液，測定，以信噪比3倍計算的施普睿達的最低檢測限為8 ng；以信噪比10倍計算的施普睿達的最小定量限20 ng。

2.6 精密度試驗

取對照品貯備液5 mL，置于10 mL容量瓶內，加流動相稀釋至刻度，按上述色譜條件，重復進樣6次，測定施普睿達峰面積，計算其RSD＝0.23%。

2.7 溶液穩定性試驗

取供試品溶液2 mL，置于10 mL容量瓶內，加流動相稀釋至刻度，同時，在24 h內每2 h進樣1次測定，記錄峰面積并計算得RSD＝0.45%。結果表明該供試品溶液穩定，能滿足測定要求。

2.8 重復性試驗

取同一批施普睿達供試品分6次取樣，精密稱定5 mg，加流動相溶解并稀釋成0.5 mg·mL－1溶液，按上述色譜條件測定，6次測定結果的含量平均RSD值為2.63%，結果表明該法重復性好。

2.9 回收率試驗

精密量取1 mg·mL－1供試品1 mL，共10份，置于10 mL容量瓶中，分別精密量取對照品（1 mg·mL－1）貯備液0.5、1、1.5 mL各3份，置于加入供試品的容量瓶內，加流動相稀釋至刻度，按上述色譜條件測定。測得樣品峰面積，求得回收率，結果其平均回收率為100.0%，RSD＝1.25%，詳見表1。

表1 回收率試驗結果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

2.10 樣品含量測定

在上述色譜條件下，精密量取對照品溶液和供試品溶液各10 μL進樣，記錄色譜，按外標法以峰面積計算供試品的含量。結果，批號為2009316、2009319、2009409的施普瑞達標示含量分別為99.20%、95.30%、97.54%。

3 討論

本試驗曾考察了組成為冰醋酸-乙腈，以及不同濃度、不同pH的磷酸鹽緩沖液-乙腈組成的流動相系統的色譜行為，最后確定本文所用的流動相，并證實在該條件下所得色譜峰形好，分離度符合要求；同時，所選用的色譜柱普遍、通用，方便推廣。

[1]洪 閣，劉培勛.槐屬植物生物堿化學成分及藥理作用研究進展[J].中草藥，2005，36（5）：783.

[2]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（二部）[S].2005年版.北京：化學工業出版社，2005：附錄172.