HPLC法檢測鹽酸多奈哌齊片中有關物質含量

曹嘉，冉蘭，陳霞

（1.四川大學華西藥學院，成都市 610041；2.四川抗菌素工業研究所，成都市 610052）

鹽酸多奈哌齊（Donepezil hydrochloride）的化學名為1-芐基-4-[（5，6-二甲氧基-1-茚滿酮）-2-基）甲基]哌啶鹽酸鹽，是治療阿爾茨海默病的第2代膽堿酯酶（AchE）抑制劑，能夠增加大腦乙酰膽堿含量，是治療早、中期老年性癡呆的有效藥物[1，2]。目前各國藥典中尚未收載該品種的有關物質的檢查方法，國內文獻亦尚未見報道。為有效控制產品質量，本文參照鹽酸多奈哌齊原料的有關物質檢查方法[3]，采用高效液相色譜（HPLC）法中常用的不加校正因子的主成分自身對照法對鹽酸多奈哌齊片中有關物質進行了檢測，以對本品進行更有效的內在質量控制。

1 儀器與試藥

LC-2010C HPLC儀，包括CLASS-VP色譜工作站（日本島津公司）。

鹽酸多奈哌齊原料（重慶桑田藥業有限公司，批號：M20071201，含量：99.8%）；鹽酸多奈哌齊標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100650-200301，含量：99.9%）；鹽酸多奈哌齊片（四川大學華西藥學院，批號：081011、081012、081013，規格：每片5 mg）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：AlltimaTMC18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：0.01 mol·L－1磷酸氫二鉀溶液（含3%三乙胺，用磷酸調pH至4.3）-甲醇（60∶40）；檢測波長：271 nm；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL·min－1；進樣量：20 μL；以鹽酸多奈哌齊峰計算，色譜柱的理論塔板數為6600，各峰與其相鄰峰的分離度均符合要求。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備。取本品10片，研細，精密稱取適量（約相當于鹽酸多奈哌齊10 mg），置于10 mL容量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，經0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.2 對照溶液的制備。精密量取供試品溶液1 mL，置于100 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 標準品溶液的制備。精密稱取鹽酸多奈哌齊標準品100 mg，置于10 mL容量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度；精密量取該溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備。按比例量稱取不含鹽酸多奈哌齊的空白輔料適量，按“2.2.1”項下方法制成陰性樣品溶液。

2.3 檢測波長的選擇

精密稱取鹽酸多奈哌齊標準品適量，用流動相溶解制成每1 mL中含鹽酸多奈哌齊約20μg的溶液；按比例量稱取不含鹽酸多奈哌齊的空白輔料適量，同法制得空白輔料溶液。分別于200～400 nm波長內進行紫外掃描，結果，鹽酸多奈哌齊分別在230、271、315 nm波長處有最大吸收，而空白輔料在271、315 nm波長處無吸收。通過HPLC試驗進一步可知，采用271 nm波長進行有關物質檢測時能檢測到較多雜質峰，在315 nm波長進行測定時雜質峰數目減少。故采用271 nm作為本品有關物質的檢測波長。

2.4 專屬性試驗

2.4.1 輔料干擾考察。照“2.1”項下的色譜條件，精密量取陰性樣品溶液、標準品溶液、供試品溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜，見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.陰性樣品；B.標準品；C.供試品；1.鹽酸多奈哌齊Fig 1 HPLC chromatogramA.negative sample；B.standard sample；C.test sample；1.donepezil hydrochloride

由圖1可知，原料雜質峰、輔料峰、主成分峰均能完全分離，輔料無干擾。

2.4.2 降解物干擾考察。精密量取供試品溶液5 mL 3份，分別進行以下試驗：加1 mol·L－1鹽酸溶液10 mL，在80℃水浴中加熱1 h；加1 mol·L－1氫氧化鈉溶液4 mL，搖勻，常溫下放置5 min；加30%過氧化氫溶液1 mL，在60℃水浴中加熱10 min。另取本品10片2份，精密稱定，分別進行以下試驗：置于白熾光（4500照度）下照射7 d；置于130℃烘箱中加熱1 h。將上述破壞后樣品分別制成每1 mL中約含1 mg鹽酸多奈哌齊的降解溶液，照“2.1”項下的色譜條件，精密量取上述降解溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜。結果破壞試驗產生的降解產物峰均能與主成分峰完全分離。

2.5 檢測限考察

取供試品溶液用流動相稀釋成系列濃度，進樣，當信噪比為3時進樣量即為最低檢測限。測得最低檢測限為0.05 ng（S/N＝3）。

2.6 耐用性試驗

在“2.1”項色譜條件的基礎上，對流動相的組成、柱溫、流速、同類型不同品牌的色譜柱等進行耐用性考察，其中流動相比例分別為磷酸氫二鉀溶液-甲醇（60∶40）、磷酸氫二鉀溶液-甲醇（59∶41）、磷酸氫二鉀溶液-甲醇（61∶39）；柱溫分別為30 ℃、35 ℃、40 ℃；流速分別為0.9、1.0、1.1 mL·min－1；pH值分別為4.30、4.32、4.34；色譜柱分別為AlltimaTMC18（250 mm×4.6 mm，5μm）、資生堂 ODS柱（250 mm×4.6 mm，5μm）。結果，當系統條件發生微小變化時，測定結果不受影響，各色譜峰之間均能達到有效的分離。說明本法的耐用性良好，符合測定要求。

2.7 有關物質測定

照“2.1”項下的色譜條件，精密量取對照溶液20 μL注入液相色譜儀，調節檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的25%；再精密量取供試品溶液與對照溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜至主成分峰保留時間的2.5倍。供試品溶液的色譜中如顯雜質峰，單個雜質峰面積不得大于對照溶液主峰面積的1/2（0.5%），各雜質峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積（1.0%）。3批樣品有關物質測定結果見表1。

表1 3批樣品有關物質測定結果Tab 1 Determination of related substance in 3 batches of samples

3 討論

在進行色譜條件篩選時，曾使用不同品牌的150 mm C18色譜柱進行試驗，經多次調整均不能到達有效分離的要求，最終確定使用250 mm C18柱。

在進行色譜條件優化時，發現主峰拖尾較為嚴重，后來加入適量三乙胺，可以改善主峰峰形。

破壞試驗結果表明，本品對光、強酸、熱等因素較穩定，而對堿、氧化等因素較敏感。

綜上所述，本方法專屬性強、靈敏度高，可用于該制劑中有關物質的檢測。

[1]Ihara M，Ohxishi A，Tomono Y，et al.Pharmacokinetics of E2020，a new compound for Alzheimer’s disease，in healthy male volunteers[J].Int J Clin Pharm Ther Toxi，1993，31（5）：223.

[2]OhnishiA，MiharaM，Kamakura H，et al.Comparison of the pharmacokinetics of E2020，a new compound for Alzheimer’s disease，in healthy young and elderly subjects[J].J Clin Pharmacol，1993，33（11）：1086.

[3]國家食品藥品監督管理局國家藥品標準[S].WS1-（X-140）-2004Z.