復方苦芩軟膏質量標準研究

張 沂，王 強，蔡清宇，任婷麟，于春令，郝 特，吳 迪

（海軍總醫院藥劑科，北京市 100048）

復方苦芩軟膏是我院藥劑科自主研制的外用乳膏劑，具有消炎、鎮痛、抗變態反應及保護創面、潤滑皮膚的作用，臨床用于海洋生物蟄傷、蚊蟲咬傷等癥的治療。為了保證制劑質量，筆者采用薄層色譜（TLC）法對軟膏中蘆薈苷、黃芩苷、薄荷腦3種成分進行定性鑒別；用高效液相色譜（HPLC）法在同條件下，測定該制劑中有效成分延胡索乙素、黃芩苷的含量。本法具有方便快捷、準確和重復性好的特點，可作為該制劑的質量控制標準。

1 材料

1.1 儀器

LC-10A HPLC儀，包括LC-10AD泵、CTO-10A柱溫箱、CLASS-VP工作站（日本島津公司）；AT-261型萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler Telode公司）；ME-2155型十萬分之一電子分析天平（德國Suiropras公司）；KQ-300E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DGG-9053A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司）；CX41型掃描電鏡（日本Olympus公司）。

1.2 試藥

復方苦芩軟膏（規格：每支15 g，批號：090625、090702、090728）及陰性樣品由海軍總醫院提供；延胡索乙素（批號：110726-200610）、黃芩苷（批號：110715-200815）、蘆薈苷（批號：110787-200303）、苦參堿（批號：110805-200507）、薄荷腦（批號：110728-200506）對照品均購自中國藥品生物制品檢定所；乙腈為色譜純，水為雙蒸水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 定性鑒別

2.1.1 蘆薈苷的TLC鑒別 取本品1 g，加無水乙醇30 mL，超聲30 min，濾過，揮干，加無水乙醇5 mL使溶解，作為供試品溶液；另取蘆薈苷[1]對照品，加無水乙醇制成每1 mL含5 mg的溶液，作為對照品溶液。照TLC法[2]試驗，吸取供試品溶液、對照品溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（100∶17∶13）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%氫氧化鉀甲醇溶液，在365 nm紫外燈光下檢視。結果，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。蘆薈苷的TLC見圖1。

2.1.2 黃芩苷的TLC鑒別 取本品1 g，加乙酸乙酯-甲醇（3∶1）混合液30 mL，超聲30 min，濾過，蒸干，加無水乙醇5 mL使溶解，作為供試品溶液；另取黃芩苷[3]對照品，加無水乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取供試品溶液、對照品溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5∶3∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鐵乙醇溶液。結果，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。黃芩苷的TLC見圖2。

圖1 蘆薈苷的TLC1～3.供試品；4.陰性對照；5.蘆薈苷對照品Fig 1 TLC of alion1～3.test sample；4.negative control；5.alion control

2.1.3 薄荷腦的TLC鑒別 取“2.1.1”項下的供試品溶液為供試品溶液；另取薄荷腦[4]對照品，加無水乙醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取供試品溶液、對照品溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-醋酸乙酯（85∶15）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。結果，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。薄荷腦的TLC見圖3。

圖2 黃芩苷的TLC1～3.供試品；4.黃芩苷對照品；5.陰性對照Fig 2 TLC of baicalin1～3.test sample；4.baicalin control；5.negative control

圖3 薄荷腦的TLC1～3.供試品；4.薄荷腦對照品；5.陰性對照Fig 3 TLC of menthol1～3.test sample；4.menthol control；5.negative control

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbox Edipse-XDB C18（150 mm×4.6 mm，5μm）；柱溫：40℃；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（22∶78）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：280 nm；進樣量：5μL。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取延胡索乙素對照品，加95%乙醇制成每1 mL含0.131 mg的溶液，即得延胡索乙素對照品溶液；精密稱取黃芩苷對照品，加95%乙醇制成每1 mL含0.1007 mg的溶液，即得黃芩苷對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取裝量差異項下的本品適量，混勻，取約0.5 g，精密稱定，置于錐形瓶中，精密加入95%乙醇溶液100 mL，稱重，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）15 min，用95%乙醇補足失重，樣品冷浸12 h后，濾過，取續濾液，即得。

2.2.4 空白試驗 按處方中藥的比例，按“2.2.3”項下方法制備不含延胡索乙素及黃芩苷的陰性對照溶液，并按上述方法進行測定。結果，在延胡索乙素及黃芩苷的色譜峰處均未發現吸收峰，表明無干擾。色譜見圖4。

圖4 高效液相色譜圖A.延胡索乙素對照品；B.黃芩苷對照品；C.供試品；D.陰性對照；1.延胡索乙素；2.黃芩苷Fig 4 HPLC chromatogramsA.tetrahydropalmatine control；B.baicalin control；C.test samples；D.negative control；1.tetrahydropalmatine；2.baicalin

2.2.5 線性關系考察 （1）精密稱取延胡索乙素對照品適量，加95%乙醇制成每1 mL含0.655 mg的溶液，作為對照品貯備液。分別精密量取對照品貯備液0.4、0.8、1.2、2.0、4.0、10.0 mL，置10 mL量瓶中，加95%乙醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取對照品溶液各5 μL，注入HPLC儀，按上述色譜條件測定峰面積。以峰面積積分值（Y）為縱坐標，延胡索乙素進樣量（X，μg）為橫坐標，制備標準曲線，得回歸方程為Y＝921919X+9609.1（r＝0.9999）。結果表明，延胡索乙素進樣量在0.131～3.275 μg范圍內與峰面積積分值呈良好的線性關系。（2）精密稱取黃芩苷對照品適量，加95%乙醇制成每1 mL含1.007mg的溶液，作為對照品貯備液。分別精密量取對照品貯備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mL，置10 mL量瓶中，加95%乙醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取對照品溶液各5 μL，注入HPLC儀，按上述色譜條件測定峰面積。以峰面積積分值（Y）為縱坐標，黃芩苷進樣量（X，μg）為橫坐標，制備標準曲線，得回歸方程為Y＝3000000X－33326（r＝0.9999）。結果表明，黃芩苷進樣量在0.05035～2.014 μg范圍內與峰面積積分值呈良好的線性關系。

2.2.6 穩定性試驗 取本品（批號：090728），按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件于0、2、4、6、8、10 h進樣，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算含量。結果，延胡索乙素的RSD＝0.38%，黃芩苷的RSD＝0.15%，表明供試品溶液在10 h內穩定，本方法有良好的穩定性。

2.2.7 重復性試驗 取樣品（批號：090728），按“2.2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，分別進樣，測定其含量。結果，延胡索乙素的RSD＝0.97%，黃芩苷的RSD＝2.00%，表明方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 取已知含量的樣品（批號090728，延胡索乙素含量：17.91mg·g-1，黃芩苷含量：19.00 mg·g-1）約2.500 g（6份），精密稱定，分別精密加入延胡索乙素對照品及黃芩苷對照品溶液適量，按供試品溶液的制備方法操作，測定含量，計算回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test（n＝6）

2.2.9 樣品含量測定 依“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，依相同色譜條件，以外標法計算3批樣品（批號：090625、090702、090728）的含量，結果見表2。

表2 樣品中延胡索乙素及黃芩苷含量測定結果（n＝3）Tab 2 Content determination of tetrahydropalmatine and baicalin in samples（n＝3）

3 討論

3.1 關于TLC鑒別

在本次復方苦芩軟膏的質量標準研究過程中，經多方資料查詢及反復試驗篩選研究，選出上述幾種無干擾且重復性好的藥味鑒別，且提取和鑒別方法均簡便有效。經多批樣品驗證，均能檢出與對照品相同的斑點，在TLC方面為本制劑提供了比較全面準確的質量控制方法。其中，蘆薈苷易氧化，供試品制備后應盡快點樣鑒別。

3.2 前處理條件的選擇

試驗中在對溶劑的選擇上，比較了甲醇和95%乙醇、95%乙醇冷浸12 h的處理效果。結果表明，3種方法的效果差別不大，但乙醇的毒性小，且冷浸后能更好地將乳膏中的基質除去，故選擇95%乙醇冷浸12 h的處理方法。對于提取溶劑量的選擇，試驗中分別采用95%乙醇25、50、100、200 mL進行提取，分別測定單位質量延胡索乙素和黃芩苷峰面積。結果表明，95%乙醇100 mL提取延胡索乙素和黃芩苷均為最優，能將有效成分提取完全。為更好地除去乳膏中的基質，試驗比較了硅藻土柱和聚酰胺柱的處理效果。結果表明，2種方法均對所測成分有吸附，故不采用該法，而選用95%乙醇冷浸12 h的處理方法。

3.3 耐用性試驗

試驗中，選用乙腈-0.1%磷酸溶液（20∶80）、乙腈-0.1%磷酸溶液（22∶78）、乙腈-0.1%磷酸溶液（24∶76）3種流動相進行比較。圖譜顯示，選用乙腈-0.1%磷酸溶液（20∶80）的圖譜，圖中峰型較寬；選用乙腈-0.1%磷酸溶液（24∶76）的圖譜，兩峰間距較窄；而選用乙腈-0.1%磷酸溶液（22∶78）的圖譜，分離效果最好。最終選定乙腈-0.1%磷酸溶液（22∶78）流動相系統，使延胡索乙素和黃芩苷達到基線分離。

[1]韓建偉，張 莉.HPLC法測定復方元胡止痛貼膏中延胡索乙素含量[J].中國藥師，2009，12（5）：621.

[2]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學工業出版社，2005：附錄31.

[3]張 蓮.HPLC法測定婦女痛經丸中延胡索乙素的含量[J].海峽藥學，2009，21（3）：63.

[4]張良曉.高效液相色譜在藥物分析中的應用研究進展[J].內蒙古石油化工，2005，7：3.