大孔吸附樹脂對白花泡桐葉中熊果酸的富集研究

余曉暉， 趙 磊， 陳旅翼， 吳定慧， 陳宇紅

（1.甘肅中醫學院，甘肅蘭州 730000;2.西北第二民族大學，寧夏 銀川 750001）

玄參科泡桐屬植物是我國獨有屬，該屬植物共七種，白花泡桐葉為玄參科（Scrophulariaceae）泡桐屬（Pauline SiebelSuck）植物白花泡桐的葉，是一種常用中草藥，其花、葉、皮、根、果古代就有藥用記載，如《本草綱目》記述:“桐葉……主惡蝕瘡著陰，皮主五痔，殺三蟲。花主傅豬瘡，消腫生發。”［1］近年來研究發現具有消炎、止咳、利尿、降壓等作用［2］。李曉強等對白花泡桐葉化學成分研究分離得到包括熊果酸在內的8個化合物［3］;陳旅翼等對白花泡桐不同部位的熊果酸含量進行測定，其葉中含量可達11.71 mg/g。［4］熊果酸（ursolic acid）又名烏蘇酸、烏索酸，是廣泛存在于天然植物中的一種五環三萜類化合物，有研究表明熊果酸具有鎮靜、抗炎、抗菌、降血糖等多種生物學效應［5］。

大孔吸附樹脂是20世紀60年代發展起來的一類有機高聚物吸附劑，具有物理化學穩定性高，吸附選擇性強，解吸條件溫和，不受無機物存在的影響;它再生簡便，使用周期長，宜于循環使用，節省費用等諸多優點［6］，近十余年來逐漸應用于中草藥化學成分的提取分離和中藥新藥的開發研制。作為一項提取分離純化的新技術，有利于解決中藥提取分離中長期以來存在的諸多問題。大孔吸附樹脂用于白花泡桐葉提取分離方面的研究還未見報道，本文優選了5種不同型號大孔吸附樹脂對白花泡桐葉中熊果酸進行富集分離研究，為熊果酸富集分離開辟新路。

1 材料與儀器

1.1 材料 甲醇為色譜純，水為二次重蒸餾水，其余試劑均為分析純。熊果酸對照品購自中國藥品生物制品檢定所，批號742－8902。白花泡桐葉植物樣品2005年采自蘭州大學醫學院校區內，經蘭州大學藥學院生藥教研室馬志剛教授鑒定為玄參科泡桐屬的白花泡桐（Panlownia Fortunei（seem.））。大孔樹脂購于天津市海光化工有限公司。參數見表1。

表1 大孔吸附樹脂的技術參數

1.2 儀器 高效液相色譜儀（Agilent），Agilent 1100 series泵及檢測器（Agilent 1100化學工作站），KQ－250TD高頻數控超聲波清洗器（昆明超聲儀器有限公司），水浴鍋（金壇市正基儀器有限公司）。

2 方法與結果

2.1 熊果酸的含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備 精確稱取熊果酸對照品5.18 mg置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成含熊果酸0.518 mg/mL的溶液，搖勻即得。

2.1.2 色譜條件的選擇 色譜柱:Hypersil－ODS2柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm），流動相:甲醇－水（88∶12），流速0.8 mL/min，檢測波長 220 nm，柱溫 25℃，進樣量 10 μL，靈敏度:0.05AUFS。

2.1.3 標準曲線及線性范圍 精密吸取對照品溶液 1、3、5、7、9 μL 分別進樣，以對照品的峰面積為縱坐標（Y），以對照品溶液的進樣量為橫坐標（X）繪制標準曲線，回歸方程為:Y=169.19X－8.735 3，r=0.999 9。結果表明:熊果酸在0.518～4.662 μg范圍內線性良好。

2.2 大孔吸附樹脂富集熊果酸的工藝考察

2.2.1 上樣液的制備 稱取白花泡桐葉細粉200 g，以濃度95%乙醇，白花泡桐葉粒徑0.46 mm，液固比11∶1，溫度85 ℃，提取次數2次，2.5 h/次，合并提取液，減壓回收，50℃真空干燥，得熊果酸粗品。精密稱取熊果酸粗品2 g，加甲醇40 mL溶解，用10%NaoH調pH=11，抽濾，濾液用10%HCl調pH=4，再加入等體積的pH=4的酸性水溶液稀釋，靜置20 min，抽濾得沉淀，用甲醇溶解并定容，在

2.1.2項色譜條件下測定，根據回歸方程得到樣品中熊果酸的濃度為2.322 mg/mL。

2.2.2 大孔吸附樹脂的預處理［6］用95%乙醇在室溫條件下浸泡24 h，其間每隔15 min攪拌1次，每次浸泡2 h后濾出乙醇，加入新乙醇，最后用去離子水洗凈;用4%鹽酸室溫浸泡3 h，再用去離子水洗凈;用5%NaOH室溫浸泡3 h，再用去離子水洗凈;用去離子水室溫浸泡24 h，使樹脂充分溶脹備用。

2.2.3 靜態吸附的測定 取2.2.1項的上樣液5份，50 mL/份，平行3份，分別加入5種預處理后的樹脂5 g，室溫下放置24 h，適當振搖，濾過藥液，蒸餾水洗滌至洗脫液100 mL，按2.1.2項色譜條件測定吸附后溶液中熊果酸的濃度，計算靜態飽和吸附量，見表2。

表2 不同樹脂對熊果酸的吸附量比較（n=3）

從表1可以計算出它們的平均孔徑大小次序AB－8＞D1400＞D101＞DM301＞DA201，該次序與其靜態吸附量的大小次序一致，表明宜用孔徑較大的樹脂吸附熊果酸。

2.2.4 靜態解吸的測定 將2.2.3項靜態吸附飽和的樹脂精密加入50 mL 90%乙醇，放置24 h，適當振搖，過濾，蒸餾水洗滌至洗脫液100 mL，定容，按

2.1.2項色譜條件測定并計算洗脫液濃度。見表3。

表3 不同樹脂解吸所得熊果酸濃度比較（mg/mL）

結果表明AB－8型大孔樹脂對熊果酸具有較好的吸附作用且易被解吸，故選用AB－8型大孔樹脂進一步的研究。

2.2.5 靜態吸附與解吸溶劑的選擇 取2.2.1項下熊果酸粗品，按2.2.1項下的方法，用60%、70%、80%、90% 乙醇、甲醇配制，用 AB－8樹脂按

2.2.3的方法靜態吸附并計算靜態吸附率;再用60%、70%、80%、90%乙醇、甲醇按2.2.4的方法解吸并計算靜態解吸率;見表4。

表4 不同溶劑對熊果酸靜態吸附量與解吸率

由表可知:AB－8樹脂在60%乙醇中對熊果酸的吸附率最大，而在90%乙醇中的吸附率最小。AB－8樹脂在90%乙醇中對熊果酸的解吸率最大，而在60%乙醇中的解吸率最小。

2.2.6 AB－8樹脂吸附動力學過程 取5 g AB－8樹脂加入60 mL 2.2.1項的上樣液，于25℃下恒溫振蕩，每隔一段時間取樣，按2.1.2項色譜條件測定熊果酸的濃度。以吸附量對吸附時間作圖，見圖1。

圖1 不同時間熊果酸吸附量圖

結果表明，樹脂對熊果酸的吸附量隨時間而變化，吸附時間延長，吸附量增加，吸附1 h后，吸附量趨勢減緩，樹脂逐漸達到飽和吸附量。同時計算出相應時間間隔內樹脂對熊果酸的平均吸附速率，再以吸附速率與時間作圖見圖2。樹脂對熊果酸的吸附速率隨時間而變化，0～40 min吸附速率較快，40 min以后吸附速率減緩，50 min以后吸附速率幾乎沒有變化，吸附飽和。

圖2 AB-8樹脂吸附速率曲線

2.2.7 驗證實驗 根據上述實驗結果，按最優化條件:4.1項條件提取，AB－8型樹脂用60%乙醇為吸附溶劑，90%乙醇為解吸溶劑，重復3批實驗，結果熊果酸含量分別為82.30%、84.20%、82.57%，RSD為0.83%。熊果酸回收率分別為86.97%、87.89%、90.22%，RSD為1.37%。

2.2.8 富集程度的考察 白花泡桐葉藥材按4.1項條件提取、回收溶劑、干燥恒重，得樣品（1）;樣品（1）經AB－8大孔吸附樹脂吸附、解析、回收溶劑、干燥恒重，得樣品（2）;4.1項條件提取液經4.2項方法處理后，經AB－8大孔吸附樹脂吸附、解析、回收溶劑、干燥恒重，得樣品（3）。按2.1.2項色譜條件測定，計算熊果酸經上述3種方法處理后的純度和回收率，結果熊果酸純度含量分別為10.11%、35.68%、83.02%，熊果酸回收率分別為96.51%、90.50%、88.36%。

4 小結與討論

4.1 上樣液提取工藝篩選 經單因素篩選及正交試驗，得到上樣液的提取的條件為:以95%乙醇為提取液，泡桐葉粒徑為0.46 mm，液固比11∶1，溫度85℃，提取次數2次，2.5 h/次，熊果酸的浸出率達99.28%。

4.2 前期預實驗中直接以4.1項下乙醇提取液上大孔吸附樹脂，富集熊果酸的吸附較好，但在解吸熊果酸時，雜質也隨著解析出來;后經單因素考察得到粗品先用10%NaOH調pH為11，抽濾，濾液用10%HCl調pH為4，再加入等體積的pH=4的酸性水溶液稀釋，靜置20 min，抽濾，沉淀，重新溶解上AB－8大孔吸附樹脂，得到了純度較高的熊果酸。

4.3 本實驗選擇了5種性能不同的樹脂進行研究，以AB－8大孔吸附樹脂富集熊果酸的純度達83.02%，對分離熊果酸有一定的指導意義。

［1］中國科學院，中國植物志編輯委員會，中國植物志［M］.北京:科學出版社，1976，67（2）:281.

［2］江蘇新醫學院，中藥大辭典［M］.上海:上海人民出版社，1977:1778.

［3］李曉強，武靜蓮，曹斐華，等.白花泡桐葉的化學成分研究［J］.中藥材，2008，31（6）:850－852.

［4］陳旅翼，趙 磊，余曉暉，等.白花泡桐不同部位的熊果酸含量測定［J］.中藥材，2007，30（8）:914－915.

［5］肖坤福，鄭云法，劉成左，等.熊果酸的研究進展［J］.時珍國醫國藥，2005，16（12）:.

［6］劉 斌，石任兵，余 超.影響大孔吸附樹脂吸附分離中草藥化學成分的因素［J］.中草藥，2002，33（5）:475－476.