響應(yīng)面分析法優(yōu)化加速溶劑萃取當(dāng)歸中阿魏酸的工藝參數(shù)

周桂芬， 呂圭源*， 陳素紅

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州 310053;2.溫州醫(yī)學(xué)院，浙江溫州 325035）

從當(dāng)歸中提取阿魏酸2005年版《中國藥典》采用回流法，文獻(xiàn)中還有超聲等提取方法，但這些方法操作步驟復(fù)雜，耗時長，所需溶劑較大，已不適應(yīng)現(xiàn)代分析要求，加速溶劑萃取（Accelerated solvent extraction，ASE）是在較高溫度（50～200℃）和壓力（10.3～20.6 MPa）條件下，采用有機(jī)溶劑從固體或半固體基質(zhì)中提取分析物，具有萃取時間短、溶劑用量少、提取分離一體化、提取率高、操作模式多樣化、自動化程度較高及重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)的一種新型提取法［1－4］。目前已被美國環(huán)境保護(hù)局（EPA）收錄為處理固體樣品的標(biāo)準(zhǔn)方法之一，隨著中藥熱在全球興起以及加速溶劑提取技術(shù)研究的深入，這項(xiàng)技術(shù)在中藥的質(zhì)量控制中應(yīng)用前景廣泛。本實(shí)驗(yàn)以阿魏酸為指標(biāo)，采用響應(yīng)面分析法對當(dāng)歸的加速溶劑萃取參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化研究，并與2005年版《中國藥典》當(dāng)歸項(xiàng)下的阿魏酸的回流提取法比較，驗(yàn)證加速溶劑提取法的優(yōu)越性。

1 儀器與材料

ASE－200加速溶劑提取儀（美國Dionex公司）;Agilent1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司）。當(dāng)歸購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)陳孔榮老師鑒定為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根;阿魏酸對照品（供含量測定用，批號:110773－200611，購自中國藥品生物制品檢定所）;乙腈為色譜純（美國Merck公司），其余化學(xué)試劑均為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件［5］

參照2005年版《中國藥典》當(dāng)歸項(xiàng)下，選擇乙腈－0.085%磷酸溶液（17∶83）為流動相，對阿魏酸進(jìn)行含量測定。色譜柱:DiamonsilTM（鉆石）C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）;流速:1 mL/min;柱溫:35 ℃;檢測波長:323 nm。理論塔板數(shù)按阿魏酸計(jì)不低于3 000，阿魏酸與相鄰色譜峰之間分離度大于1.5。

2.2 阿魏酸含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取10.02 mg阿魏酸對照品加入50 mL量瓶中，用色譜甲醇定容至刻度，作為貯備液，于4℃條件下保存。從中精密移取2 mL，用色譜甲醇定容至25 mL，得阿魏酸對照品的濃度為 16.032 μg/mL。

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取當(dāng)歸藥材粗粉1.0 g置小燒杯中，然后與2 g硅藻土進(jìn)行完全混合，按照加速溶劑萃取儀樣品制備程序，以70%甲醇為溶劑，按響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表1選擇因素和水平進(jìn)行提取，萃取后的溶液用70%甲醇定容至50 mL，0.22 μm的微孔濾膜過濾。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取濃度為16.032 μg/mL的阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品，分別進(jìn)樣 1、2、4、6、8、10 μL。按上述色譜條件測定峰面積，以阿魏酸進(jìn)樣量X為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程為Y=3 518.5X－1.367 7，r=1。結(jié)果表明，阿魏酸在0.016 032 μg～0.200 4 μg范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

2.2.4 樣品測定 按響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案，參照2.2.2項(xiàng)下，制備15份樣品，分別精密吸取阿魏酸對照品溶液（濃度16.032 μg/mL）5 μL 和 15 μL 與供試品溶液15 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行測定，即得。采用外標(biāo)兩點(diǎn)法進(jìn)行計(jì)算，測定結(jié)果見表2。

2.2.5 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 選擇靜態(tài)萃取時間X1、加熱溫度X2和循環(huán)次數(shù)X3三個因素為自變量，以阿魏酸提取率為響應(yīng)值（Y），根據(jù)Box－Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法，試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

3 結(jié)果和分析

3.1 響應(yīng)面分析 按表1響應(yīng)面分析因素及水平表試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

3.2 多元二次響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

采用SAS9.0軟件對表2結(jié)果進(jìn)行二次回歸響應(yīng)面回歸分析，建立多元二次響應(yīng)面回歸模型，得擬合方程:

其中，Y是效應(yīng)值，即阿魏酸含量，X1、X2和X3是自變量，即靜態(tài)萃取時間、加熱溫度和循環(huán)次數(shù)三個考察因素，因素的方差分析見表3。

在95%置信區(qū)間，線性相關(guān)系數(shù)R=0.995 9，說明擬合方程模型能較好地描述本試驗(yàn)結(jié)果。

由表3可知，回歸方程可靠，可用于替代實(shí)驗(yàn)點(diǎn)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。同時，方程一次項(xiàng)、二次項(xiàng)和交互相均有顯著性影響（P＜0.01），因此各因素與指標(biāo)之間并不是簡單的線性關(guān)系，而是二次關(guān)系。并進(jìn)一步對回歸方程各項(xiàng)作顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表4。

表2 響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 回歸方程各項(xiàng)顯著性檢驗(yàn)

表4 回歸方程顯著性檢驗(yàn)及方差分析

由表4可知，X1和X2有特顯著性（P＜0.01）和X3均具有顯著性（P＜0.05），綜合表3，進(jìn)一步說明各因素與指標(biāo)之間不是簡單的線性關(guān)系，而是二次關(guān)系。我們以上面擬合的數(shù)學(xué)模型為基礎(chǔ)，描繪了等值線圖和自變量對因變量的三維響應(yīng)面圖。分別將其中一個因素固定在中心值，以阿魏酸含量對另外兩個因素描繪三維圖，見圖1～6。經(jīng)分析計(jì)算后可知，最優(yōu)提取條件為:靜態(tài)萃取時間13.28 min，加熱溫度93.8℃，循環(huán)次數(shù)2.07次，在此條件下，當(dāng)歸阿魏酸提取得率理論值為0.079 20%。但考慮到實(shí)際生產(chǎn)條件及方差分析結(jié)果，確定優(yōu)化提取條件為:靜態(tài)萃取時間13 min，加熱溫度94℃，循環(huán)次數(shù)2次。并按此條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測定阿魏酸含量為0.078 79%。

圖1 y=f（x1，x2）的等值線圖（x3=0）

圖2 y=f（x1，x2）的響應(yīng)面圖（x3=0）

圖3 y=f（x2，x3）的等值線圖（x1=0）

圖4 y=f（x2，x3）的響應(yīng)面圖（x1=0）

圖5 y=f（x1，x3）的等值線圖（x2=0）

4 與回流提取法和超聲提取法比較

回流提取:按照2005年版《中國藥典》一部當(dāng)歸項(xiàng)下［5］。

圖6 y=f（x1，x3）的響應(yīng)面圖（x2=0）

超聲提取:取本品粉末（過三號篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇100 mL，密塞，稱定重量，超聲 30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，靜置，取上清液用微孔濾膜（0.22 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。

與加速溶劑提取法比較，結(jié)果見表5。從表5中的測定結(jié)果可以看出，采用加速溶劑提取法提取當(dāng)歸中的阿魏酸的提取率較回流法和超聲法高20%以上，而回流法和超聲法的提取率沒有明顯差異。加速溶劑提取法與回流提取法和超聲提取法相比，具有提取所需溶劑少、提取效率高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，并且操作方便可自動化控制。可見，加速溶劑提取法是一種適于提取當(dāng)歸中的阿魏酸的新方法，比藥典的回流提取方法的提取效率明顯增高。

表5 ASE與回流提取法和超聲提取法比較

5 結(jié)論與討論

5.1 本實(shí)驗(yàn)采用加速溶劑萃取法對當(dāng)歸中的阿魏酸進(jìn)行提取，并通過實(shí)驗(yàn)確定了加速溶劑萃取當(dāng)歸中阿魏酸的最佳試驗(yàn)參數(shù):加熱溫度94℃、靜態(tài)萃取時間13 min和靜態(tài)循環(huán)次數(shù)為2次。結(jié)果表明，該方法與傳統(tǒng)提取方法（回流提取法和超聲法）相比具有提取效率高、萃取時間短、溶劑用量少等絕對優(yōu)勢;此法也可用于其他中草藥化學(xué)成分的分析，為中藥有效成分的基礎(chǔ)研究提供了一種新的高效、快速、安全、節(jié)能的分析方法。

5.2 影響加速溶劑提取效率的因素很多，包括溶劑種類、藥材粒徑、提取溫度、提取壓力、靜態(tài)萃取時間以及循環(huán)次數(shù)等。2005年版《中國藥典》當(dāng)歸項(xiàng)下，使用70%的甲醇為提取溶劑，所以本文未對提取溶劑進(jìn)行考察，直接使用70%甲醇。由于壓力的改變對提取效率的影響不大，高壓的作用主要是用于維持溶劑在高溫下始終處于液體狀態(tài)，大多數(shù)情況下壓力的范圍是1 000～2 000 psi，1 500 psi是推薦的工作壓力，故提取壓力設(shè)定為1 500 psi。實(shí)驗(yàn)直接對靜態(tài)萃取時間、加熱溫度和循環(huán)次數(shù)三個因素進(jìn)行了響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)考察。ASE的其他提取參數(shù)采用系統(tǒng)預(yù)設(shè)值:preheat=0 min，heat=5 min，flush%=60 vol，purge=60 s，pressure=1 500 psi。

5.3 響應(yīng)面分析法由Box及其合作者于20世紀(jì)50年代提出并逐步完善，它以回歸方程作為函數(shù)估算的工具，將多因子試驗(yàn)中因素與試驗(yàn)結(jié)果的關(guān)系用多項(xiàng)式擬合，將因子與實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)系函數(shù)化，因此，可對函數(shù)的面進(jìn)行分析，研究因子與響應(yīng)值之間、因子與因子之間的相互關(guān)系，并進(jìn)行優(yōu)化。它克服了正交實(shí)驗(yàn)只能給出最佳因素水平組合，而無法找出整個區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值的缺陷。

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