珠子參飲片質量標準研究

宋小妹， 房 方， 蔡 皓， 蔡寶昌*

（1.南京中醫藥大學，江蘇南京 210046;2.陜西中醫學院，陜西咸陽 712046）

珠子參為五加科植物珠子參（Panax japonicusC.A.Mey.var.major（Burk.）C.Y.Wu et K.M.Feng或羽葉三七Panax japonicusC.A.Mey.var.bipinnati-fidus（Seem）C.Y.Wu et K.M.Feng的干燥根莖。主產于四川、云南、貴州、甘肅、陜西、西藏等。具有補肺、養陰、活絡、止血之功效，主要用于氣陰兩虛、煩熱口渴、虛勞咳嗽、跌撲損傷、關節疼痛、咳血、外傷出血等癥的治療［1］。化學研究表明，珠子參主要活性成分為多種皂苷類［2］。藥理實驗表明皂苷類成分具有鎮痛、鎮靜［3］、增強免疫力［4，5］、抗腫瘤［6］等活性。從現行各種標準來看，珠子參飲片的質量標準尚不完善。為此，本實驗在對珠子參系統研究的基礎上，以珠子參主要皂苷類成分人參皂苷Ro、竹節參皂苷IVa等為評價指標，對珠子參飲片進行質量評價研究，以保證其臨床用藥的安全有效。

1 實驗材料

1.1 珠子參藥材 分別購于四川、云南、貴州、湖北等地。經陜西中醫學院藥學院王繼濤高級實驗師鑒定，為珠子參Panax japonicusC.A.Mey.var.major（Burk.）C.Y.Wu et K.M.Feng的干燥根莖。

1.2 珠子參飲片 珠子參飲片為相應藥材炮制的加工品（炮制方法:取原藥材，挑出雜質，水洗，清水噴淋3次，放置5 h，切厚片。70℃干燥5 h，過篩，即得）。

1.3 儀器及試劑

1.3.1 儀器 Waters高效液相色譜儀;2996紫外檢測器，Epower工作站;SB-3200D型超聲清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司，180 W，40 kHz）;BP-121S電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）。

1.3.2 藥品與試劑 乙腈為色譜純（SK Chemicals公司）;其余試劑均為分析純;水為娃哈哈純凈水;人參皂苷Ro對照品、竹節參皂苷Ⅳa對照品（均為自制，經1HNMR、13CNMR、HMBC、HMQC 及 HR-MS確定結構;面積歸一法計算含量均大于98%，符合含量測定要求）。

2 方法與結果

2.1 飲片性狀 本品為類圓形或不規則塊片，直徑0.2～1.8 cm。表面棕黃色或黃褐色，有皺紋;切面淡黃白色，粉性;或黃白色或黃棕色，略呈角質樣。氣微，味微苦、微甘。

2.2 粉末顯微特征 本品粉末黃白色、灰白色或棕黃色。木栓細胞表面觀呈多角形，壁薄，非木化;切面觀類方形，內含紅棕色分泌物。草酸鈣簇晶多，整個薄壁細胞組織均有分布，直徑20～76 μm，棱角多寬鈍，少數較尖。導管多為網紋，直徑20～46 μm，螺紋、梯紋導管可見。

2.3 薄層色譜鑒別 取本品粉末1 g，加甲醇30 mL超聲處理40 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 mL加熱溶解，水飽和正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，蒸干，殘渣加甲醇5 mL加熱溶解，作為供試品溶液。另取人參皂苷Ro對照品、竹節參皂苷Ⅳa對照品適量，加甲醇制成每1 mL各含2.0 mg的對照品溶液。照薄層色譜法（附錄Ⅵ B）試驗，分別吸取竹節參皂苷Ⅳa對照品溶液、人參皂苷Ro對照品溶液各 2 μL，供試品溶液 2 μL 和/或 5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水（5∶10∶0.5∶0.3∶3.5）上層液為展開劑展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外燈（300 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。見圖1。

2.4 檢查

2.4.1 水分測定 依照《中國藥典》2005年版（一部）水分測定法（附錄IX H第一法）進行測定。測定數據及結果見表1。

圖1 珠子參飲片薄層色譜圖1、8.分別為竹節參皂苷Ⅳa對照品、人參皂苷Ro對照品 2、3.四川樣品溶液（點樣量分別為2 μL、5 μL）4.云南樣品溶液 5.貴州樣品溶液 6、7.湖北樣品溶液（點樣量分別 2 μL、5 μL）Fig.1 TLC chromatogram of prepared pieces of Rhizoma Panacis majoris1、8.Chikusetsusaponin IVa and ginsenoside Ro reference substance 2-7.samples

表1 珠子參飲片中水分、灰分、酸不溶灰分及人參皂苷Ro、竹節參皂苷Ⅳa含量Tab.1 Determination results of prepared pieces of Rhizoma Panacis majoris

2.4.2 總灰分 依照《中國藥典》2005年版總灰分測定法（附錄IX K）進行測定。數據及結果見表1。

2.4.3 酸不溶性灰分測定 依照《中國藥典》2005年版一部總灰分及酸不溶性灰分測定法（附錄IX K）進行測定。測定數據及結果見表1。

2.5 含量測定

2.5.1 色譜條件 色譜柱:Kromasil Column C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）;流動相:乙腈-0.2%磷酸溶液（36∶64）;檢測波長:203 nm;流速:1.0 mL/min;進樣量:20 μL;柱溫:30℃;理論板數按竹節參皂苷Ⅳa峰計算應不低于3 000。

2.5.2 對照品溶液制備 分別取竹節參皂苷Ⅳa對照品和人參皂苷Ro對照品適量，精密稱定，加60%乙醇配制成竹節參皂苷Ⅳa 0.260 5 mg/mL，人參皂苷Ro 0.521 0 mg/mL的溶液，搖勻，作為對照品溶液。

2.5.3 供試品溶液配制 取珠子參粉末（過2號篩）約0.1 g，精密稱定，加60%乙醇溶液30 mL，超聲處理40 min，取出，加60%乙醇補足重量，濾過，取續濾液即得。

2.5.4 線性關系考察 取上述對照品溶液，分別進樣1、2.5、5、10、15、20 μL，測定峰面積，分別以人參皂苷Ro和竹節參皂苷Ⅳa進樣量（μg）為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，并計算回歸方程得:人參皂苷 Ro:Y=1.5×105X－7 909（r=0.999 9），竹節參皂苷Ⅳa:Y=3.2×105X－18 460（r=1）。結果表明，人參皂苷Ro在0.51～10.26 μg范圍內、竹節參皂苷Ⅳa在0.26～5.21 μg范圍內，峰面積Y與進樣量（μg）X線性關系良好。

2.5.5 精密度試驗 取對照品溶液10 μL，照2.5.1項下色譜條件，重復進樣6次，測定人參皂苷Ro和竹節參皂苷Ⅳa峰面積。結果表明，本法精密度良好，人參皂苷Ro峰面積RSD為0.68%，竹節參皂苷Ⅳa峰面積RSD為1.07%。

2.5.6 穩定性試驗 取同一供試品溶液分別于0、2、4、8、12、18、24 h 內進樣，照 2.5.1 項下色譜條件測定人參皂苷Ro和竹節參皂苷Ⅳa峰面積。結果表明，供試品溶液在24 h內峰面積穩定，人參皂苷Ro峰面積RSD為0.68%，竹節參皂苷Ⅳa峰面積RSD為1.61%。

2.5.7 重復性試驗 取同一批號樣品，平行稱取6份，按2.5.3項下方法制備供試品溶液，照2.5.1項下色譜條件測定人參皂苷Ro和竹節參皂苷Ⅳa含量。結果表明，本法具有較好的重復性，人參皂苷Ro和竹節參皂苷Ⅳa RSD分別為1.84%和1.93%。2.5.8 回收率試驗 取已知含量的樣品5份，各0.1 g，精密稱定，精密加入人參皂苷Ro和竹節參皂苷Ⅳa對照品適量，按2.5.3項下方法制備供試品溶液，按2.5.1項下色譜條件測定人參皂苷Ro和竹節參皂苷Ⅳa含量。計算回收率，見表2、表3。結果表明，本法回收率良好，人參皂苷Ro和竹節參皂苷Ⅳa的RSD分別為0.46%和0.91%。

表2 人參皂苷Ro回收率試驗結果Tab.2 Results of recovery test of ginsenoside Ro

表3 竹節參皂苷Ⅳa回收率試驗結果Tab.3 Results of recovery test of chikusetsusaponin IVa

2.5.9 樣品含量測定 取不同批次樣品粉末約0.1 g（各2份），精密稱定，按2.5.3項下方法制備供試品溶液，進樣20 μL，按2.5.1項下色譜條件進行測定，記錄色譜峰面積，計算含量，結果見表1。對照品和供試品HPLC圖譜見圖2。

圖2 珠子參飲片HPLC圖譜A.對照品 B.四川珠子參樣品 C.湖北珠子參樣品 1.人參皂苷Ro 2.竹節參皂苷ⅣaFig.2 HPLC chromatograms of prepared pieces of Rhizoma Pannacis majorisA.reference substances B.sample of sichuan C.sample of Hubei 1.ginsenoside Ro 2.chikusetsusaponin IVa

3 討論

3.1 實驗過程所用人參皂苷Ro對照品和竹節參皂苷Ⅳa對照品均為自制，其結構經1HNMR、13CNMR、HMBC、HMQC及HR-MS等方法予以鑒定確認;純度檢查采用HPLC法，面積歸一法計算含量，純度均在98%以上，分別達到了含量測定所用對照品的技術要求。

3.2 薄層色譜鑒別用于中藥鑒別具有快速簡便等特點。珠子參飲片的薄層色譜鑒別條件的確定，是在對實驗條件的系統考查基礎上確立的，而且經反復試驗證明，該方法具有分離度好、斑點清晰、簡便易行等特點，可用于珠子參飲片的鑒別。

3.3 實驗過程中，對供試品溶液制備的提取方法、提取溶媒、提取時間等條件進行了實驗考察。結果表明，該實驗條件提取率高、雜質少、操作簡便，可用于珠子參飲片的提取。

3.4 本試驗首次建立了HPLC法同時測定珠子參飲片中人參皂苷Ro、竹節參皂苷Ⅳa含量的方法。該方法專屬性強、靈敏度高、重現性好，可用于評價珠子參飲片的質量。

［1］中國藥典［S］.一部.2005:192.

［2］楊崇仁，周 俊，馮寶樹，等.秦嶺產珠子參根莖的皂苷成分［J］.植物學報，1988，30（4）:403-408.

［3］李巧云，趙 恒，岳松健，等.大葉珠子參總皂甙的鎮痛鎮靜作用研究［J］.華西藥學雜志，1993，8（2）:90-92.

［4］李慧蘭，李存德.珠子參總皂甙對白細胞介素-1，白細胞介素-2的影響［J］.云南中醫學院學報，1994，17（1）:27-29.

［5］朱新華，李存德，后文俊.珠子參總皂甙對脾細胞增殖效應影響的研究［J］.昆明醫學院學報，1994，15（1）:65-67.

［6］陳 濤，崔幫平，黎家華，等.珠子參對小鼠H22肝癌抑制作用及機制［J］.世界華人消化雜志，2007，15（24）:2597-2601.