HPLC分析桃兒七中鬼臼毒素的含量

熊文勇， 魏朔南， 岳 明

（西北大學西部資源生物與現代生物技術教育部重點實驗室，陜西西安 710069）

桃兒七（Sinopodophyllum hexandrum（Royle）Ying）是小檗科鬼臼亞科桃兒七屬多年生草本植物，分布于云南、西藏、四川、湖北、陜西、青海、甘肅、寧夏等省區［1］，主要生長在海拔2700～4500 m的喜馬拉雅山及附近地區，用于治療風濕關節痛、跌打損傷、心胃痛、風寒咳嗽、月經不調、解鐵棒錘中毒等。其根和根莖中含有大量的鬼臼毒素及其衍生物，其中鬼臼毒素（podophyllotoxin）具有很高的抗癌活性，是近年來合成抗癌藥物VP－16（etoposide）和VM－26（teniposide）等的前體物質［2，3，4］。除此之外，現代研究表明，鬼臼毒素還具有抗病毒、抗免疫、抑菌殺蟲、治療牛皮癬、瘧疾、類風濕性關節炎、精神分裂癥、簇狀禿頭癥、系統性紅斑狼瘡、重癥肌無力、多發性硬化等作用［5］。

近年來的研究表明桃兒七中鬼臼毒素含量較高，可達1% ～5%［6－9］，文獻報道了用HPLC法測定桃兒七中鬼臼毒素的含量測定方法，但桃兒七中化學成分較復雜［9］，用已有的色譜方法均不能使鬼臼毒素得到很好的分離，本文采用反向高效液相色譜法，參考王曉玲（2003）等對鬼臼毒素提取分離的優化工藝［10］，系統地研究了桃兒七中的鬼臼毒素含量HPLC測定方法，克服了文獻報道中分離度低，峰形不好等缺點，同時測定了不同產地桃兒七不同營養器官中鬼臼毒素含量。該法操作簡單，準確度、靈敏度高，精密度好，易于采用，對于桃兒七質量資源的評價，快速鑒別桃兒七藥材鬼臼毒素含量，提高中藥桃兒七質量，保護瀕危物種具有現實意義。

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器 日本島津LC－10ATvp高效液相色譜儀，SPD－10Avp檢測器，Class－VP工作站。DL－180超聲波清洗器（浙江海天電子儀器廠），MA200電子天平。

1.2 試劑 鬼臼毒素標品（購自陜西藥品生物制品檢定所），乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、甲酸（分析純）均購于天津化學試劑廠，水為超純凈水，其它試劑均為分析純。

1.3 材料 實驗材料桃兒七樣品分別9月份果熟期采自寧夏六盤山、甘肅興隆山、甘肅舟曲縣插崗、四川馬爾康刷經寺、四川康定榆林鄉和云南中甸納帕海地區。

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱 Diamonsil C18（250×4.6 mm，5 μm）;流速:0.5 mL/min;檢測波長:290 nm;柱溫:30℃;進樣量:10 μL。流動相選擇乙腈（A）－0.04%甲酸水（B），梯度洗脫程序 0～4 min:85%B，4 ～25 min:85－76%B，25～45 min:76% ～75.5%B，45～60 min:75.5%－68%B，60 ～75 min:68%B，75～95 min:68% ～45%B，95～120 min:45%B。

2.2 標品溶液配制 精密稱取鬼臼毒素標品0.001 g，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即為標品溶液，進樣前用0.22 μm微孔濾膜濾過。

2.3 樣品溶液配制 取樣品桃兒七將其粉碎，過40目篩，精密稱取約0.1 g粉末，超聲波振蕩提取3次，每次30 min，加甲醇3 mL，過濾，合并濾液，定容至10 mL，過0.22 μm濾膜，備用。

2.4 線性關系考察 精密吸取鬼臼毒素標品溶液2、4、6、8、10、12、14 μL，進樣測定，記錄其高效液相色譜圖譜（圖1），以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，得回歸直線方程為Y=52 503X+38 464，r2=0.999 4。結果表明鬼臼毒素在0.2～1.4 μg間具有良好的線性關系。

圖1 鬼臼毒素對照品色譜圖

2.5 精密度試驗 取樣品桃兒七粉末，按照“樣品溶液的制備”項下的方法制成供試溶液，重復進樣5次，每次10 μL，測得鬼臼毒素峰面積的RSD=0.77%，表明本法精密度良好。

2.6 重復性試驗 取同一桃兒七樣品5份，按照“樣品溶液的制備”項下的方法制成供試溶液，每份進樣10 μL，測得鬼臼毒素峰面積的RSD=0.90%，表明本法重現性良好。

2.7 穩定性試驗 取供試品溶液分別在0、3、6、9、12、15、24、48 h進樣，每次10 μL，記錄峰面積，計算鬼臼毒素峰面積的RSD=1.97%，表明供試品溶液在48 h內穩定。

2.8 回收率試驗 精密稱取同一已知鬼臼毒素量的樣品0.100 0 g，按照“樣品溶液的制備”項下的方法制成供試溶液，準確加入鬼臼毒素對照品0.447 5 mg、0.596 5 mg和0.745 5 mg，每份相同加樣量的樣品制備供試品溶液3份，每份進樣10 μL，測定鬼臼毒素的峰面積，計算平均回收率為99.32%，RSD小于1.61%（見表1）。

表1 加樣回收率實驗結果（n=3）

2.9 樣品測定 桃兒七樣品分別9月份果熟期采自寧夏六盤山、甘肅興隆山、甘肅舟曲縣插崗、四川馬爾康刷經寺、四川康定榆林鄉和云南中甸納帕海地區，涵蓋了除西藏和陜西（2007和2008年均未能采到野生桃兒七）的國內所有主要分布區。精密稱定不同生長地、不同部位桃兒七粉末0.100 0g，按照“樣品溶液的制備”項下的方法制成桃兒七根和莖的供試溶液，用0.22 μm濾膜過濾后，進樣10 μL，重復3次，按上述色譜條件測定，記錄高效液相色譜圖（圖2），以外標法計算桃兒七樣品中鬼臼毒素含量，結果見表2。

圖2 A.樣品根色譜 B.樣品莖色譜

表2 不同生長地、不同營養器官桃兒七中鬼臼毒素含量（n=3）

3 結果

3.1 高效液相色譜圖建立 通過本研究，建立了定量分析不同生長地桃兒七不同營養器官中鬼臼毒素含量的方法及其高效液相色譜圖（圖2:A、B），實驗過程中選擇乙腈－甲酸水（0.04%）為流動相，選擇梯度洗脫的方法記錄色譜圖。此外，在實驗過程中還對檢測波長進行篩選，即選擇在210、260、290 nm處記錄了樣品的高效液相色譜圖，但是由于在210、260 nm處存在強烈背景吸收和基線不穩定等缺點，所以本研究最終確定吸收波長為290 nm。而對于記錄時間的確立，則是根據對目標成分鬼臼毒素的出峰時間和整個樣品出峰情況:鬼臼毒素在95 min出峰，而在120 min后樣品出峰數目少、峰面積小，且分離效果差，考慮到本研究重點是對鬼臼毒素定量分析，因此最終確立采集時間為120 min。通過本次研究建立的液相色譜圖，基線穩定，分離度好，為進一步進行桃兒七指紋圖譜分析建立條件。

3.2 含量測定結果 桃兒七不同生長地、不同營養器官中鬼臼毒素含量測定結果顯示（表2），桃兒七不同生長地、不同營養器官中鬼臼毒素含量均有很大差異，在不同生長地中以寧夏六盤山桃兒七的根中鬼臼毒素含量最高，其次是甘肅興隆山、四川榆林鄉和甘肅插崗、四川刷經寺等地區，而云南納帕海地區的桃兒七根中鬼臼毒素含量最低。云南納帕海桃兒七的莖中鬼臼毒素含量最高，其次是四川榆林鄉、甘肅興隆山，而四川刷經寺最低。在不同營養器官中，桃兒七根中的鬼臼毒素含量均高于莖，而且呈現自北向南含量減少的趨勢;莖中鬼臼毒素含量則沒有明顯的隨地理變化的規律。除此之外，從總含量上來看，甘肅興隆山桃兒七中鬼臼毒素含量最高，其次是云南納帕海、四川榆林鄉、寧夏六盤山，而四川刷經寺最低。

桃兒七不同生長地、不同營養器官中鬼臼毒素含量變化情況，從表2中可以看出，鬼臼毒素在寧夏六盤山根中含量最高，然而其莖中的含量較低，兩者之間存在的差異性較大;而云南納帕海、甘肅興隆山、四川榆林鄉等地采集的桃兒七，其莖中鬼臼毒素含量較高，與其在根中的含量差異較小。由此可見，從采集樣品桃兒七的生長地來看，鬼臼毒素在桃兒七不同營養器官根和莖中的分布也呈現無規則變化，沒有一定的相關性。

4 討論

4.1 現已發現桃兒七的根及根莖中主要含有木脂素類、黃酮類、皂苷、多糖及鞣質等化學成分。其中有效成分為鬼臼類衍生物，包括鬼臼毒素、去甲鬼臼毒素、鬼臼苦素、去氫鬼臼毒素、鬼臼毒酮、去氧鬼臼毒素、異鬼臼苦酮、4′－去甲鬼臼毒酮、山荷葉素等。桃兒七中的鬼臼毒素以其具有抗癌、抗腫瘤和殺蟲等作用，備受科研工作者的關注。本研究建立了桃兒七主要化學成分的高效液相色譜分析方法，以及以鬼臼毒素為指標的鬼臼毒素定量分析方法，能很好的把鬼臼毒素與桃兒七中其他鬼臼類衍生物區分開并進行精確定量。該方法定性專屬性強，定量精密度高、穩定性和重現性好，可為桃兒七HPLC指紋圖譜研究及種質資源評價建立基礎。

4.2 中草藥化學成分主要來源于植物的次生代謝產物，對后天生長環境依賴性很強，故有中藥“道地性”和“最佳采收時間”之說。陳毓亨（1979年）、王京昆（1995年）等對采收季節相同但產地不同的桃兒七成分進行測定，結果表明甘肅甘南地區所產桃兒七中鬼臼毒素的含量明顯高于四川、云南所產的桃兒七［6，7］。馬紹賓等對桃兒七不同采收季節與鬼臼毒素含量的研究表明，鬼臼毒素在5月份開花時最高（4.93%），隨著時間的延伸，含量趨于減少，最低時在3.0%左右［8］。本研究所用材料采自寧夏六盤山、甘肅興隆山、甘肅插崗、四川刷經寺、四川榆林鄉和云南納帕海等不同生長地，其桃兒七不同營養器官中鬼臼毒素含量差異顯著（表2、圖3）。從含量最高的寧夏六盤山所采樣品（根）到含量最低的四川刷經寺所采樣品（莖），鬼臼毒素含量的分布都呈現出不規則性，但就其桃兒七根中鬼臼毒素含量則存在從北向南逐漸減少的趨勢，推測可能北部寒冷高海拔地區有利于鬼臼毒素的形成積累。有趣的是在云南納帕海采集的樣品中，其莖中鬼臼毒素含量不僅高于本身根中含量，而且還高于其他部分地區根中的含量。本研究得出的結果與以上文獻報道有所不同，推測其原因可能與當地生長環境和樣品采集時間有關，而具體原因有待進一步考察。

［1］中國科學院植物研究所.中國植物志［M］，北京:科學出版社，1997.

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