干擾素生物活性兩種測定方法的比較研究

趙鴻

（北京雙鷺藥業股份有限公司，北京 100041）

干擾素（interferon，IFN）是第一個被發現的細胞因子，也是第一個應用于臨床的基因工程產品。根據其來源、理化性質、氨基酸序列和生物學活性的不同，可分為α、β、γ三種類型。IFN的作用具有種屬特異性，其主要功能有抗病毒、抗腫瘤、增強NK、Tc細胞的活性及進行免疫調節等多種生物學活性，是一類重要的細胞因子。通常干擾素生物活性測定方法是采用《中國藥典》三部附錄ⅩC細胞病變抑制法（結晶紫染色法，方法一）。由于日常實驗中發現生物活性測定曲線不理想，重復性較差，故對其操作進行一些改動，同時考慮到該實驗中間操作較多，容易引入操作誤差，故探討一種中間操作少的方法，以減少實驗誤差，提高實驗結果的準確性。MTT比色法（方法二）廣泛應用于細胞生物活性檢測，故筆者旨在通過本實驗證實改進的結晶紫染色法與MTT比色法哪一種方法更適合用于干擾素生物活性的測定，得到更為準確的實驗結果，為干擾素的臨床應用提供有力的保證。

1 材料與方法

1.1 原理

1.1.1 方法一原理 根據干擾素能刺激某些指示細胞，如人羊膜上皮細胞（WISH細胞）、人喉癌細胞（Hep2細胞）、人胚肌皮細胞和肺單層細胞（2BS細胞）等，產生抗病毒蛋白，使細胞免受牛水泡性口炎病毒（VSV）的攻擊。根據待測樣品干擾素不同稀釋度的保護能力，計算出干擾素的生物活性單位。

1.1.2 方法二原理 MTT比色法的基本原理是活細胞線粒體中富含琥珀酸脫氫酶，氧化型MTT進入細胞后可被該酶還原生成藍色formazan顆粒，沉積于細胞內或細胞周圍，經溶劑溶解后比色定量，其顏色深淺直接與活細胞數有關。

1.2 實驗試劑、材料與實驗器具

1.2.1 DMEM培養液 取DMEM培養基粉末1袋（Gibco公司，規格為1 L，批號31600-034），加水溶解并稀釋至1 000 ml，加青霉素1.0×105U和鏈霉素10.×105U，再加碳酸氫鈉2.0 g、L-谷氨酰胺 0.292 3 g（Sigma公司， 批號 G3126）、HEPES 2.838 g（Amersco公司）溶解后，混勻，過濾除菌，4℃保存。

1.2.2 基礎培養液（10%）取新生牛血清10 ml（四季青生物公司，批號061202），加DMEM培養液至100 ml，4℃保存。

1.2.3 測定培養液（7%）取新生牛血清7 ml，加DMEM培養液至 100 ml，4℃保存。

1.2.4 攻毒培養液（2%）取新生牛血清2 ml，加DMEM培養液至 100 ml，4℃保存。。

1.2.5 消化液 0.5%胰蛋白酶消化液∶0.02%EDTA=1∶1（0.5%胰蛋白酶及0.02%EDTA均用PBS溶液配制）。

1.2.6 染色液 結晶紫染色液（0.1 g+20 ml無水乙醇溶解后加水至 100 ml）。

1.2.7 脫色液 50%無水乙醇、50%蒸餾水及0.1%乙酸。

1.2.8 細胞 WISH細胞。

1.2.9 VSV-70℃凍存。

1.2.10 裂解液 取十二烷基硫酸鈉（SDS，分析純）15 g，用適量蒸餾水和50 ml DMF（N,N-二甲基甲酰胺）溶解，加蒸餾水至100 ml，用鹽酸調節pH至4.7。

1.2.11 MTT溶液 取0.5 g MTT，加 PBS溶解成 100 ml，配制成0.5%MTT溶液，經0.22 μm濾膜過濾除菌。4℃避光保存。

1.2.12 PBS溶液 取8 g氯化鈉、0.2 g氯化鉀、1.44 g磷酸氫二鈉、0.24 g磷酸二氫鉀加蒸餾水配成1 000 ml溶液，經121℃15 min高壓滅菌。

1.2.13 干擾素α活性測定國家標準品 批號97/04，-20℃貯存，7 500 IU/支。

1.2.14 器材 96孔細胞培養板若干個，百級工作臺，二氧化碳培養箱（三洋公司），酶標儀（Molecular Devices公司），生物倒置顯微鏡（COIC，重慶光學儀器廠），單道微量移液器，8道微量移液器，無菌1.5 ml塑料離心管和200 μl、1 ml tip頭若干。

1.3 測定法（以下操作均為無菌操作）

1.3.1 方法一[1]①使WISH細胞在培養基中貼壁生長，按1∶2～1∶4傳代，每周2～3次，于完全培養液中培養。輕搖WISH細胞，棄去培養瓶中的培養液，用PBS溶液洗2次后加消化液（0.5%胰蛋白酶消化液∶0.02%EDTA=1∶1，即 1.5 ml∶1.5 ml）消化，鏡下觀察消化程度，見鏡下大部分細胞離散后，吸棄消化液，立即加5 ml 10%DMEM培養液，終止消化反應，用10 ml移液管用力吹打將細胞吹散，鏡下觀察大部分細胞呈單個細胞，用10%DMEM培養液配成3.0×105個/ml的細胞懸液，接種于 96孔培養板中， 每孔 100 μl，37℃，5%CO2條件下培養4～6 h。②標準品溶液的配制：取1支干擾素活性測定國家標準品，按使用說明書復溶后，用7%DMEM培養液稀釋至1 000 IU/ml（IFN國家標準品直接加7%DMEM培養液220 μl稀釋）。在96孔培養板中，以4倍稀釋度做梯度稀釋（50 μl+150 μl），共8個稀釋度，每個稀釋度做2個復孔。供試品溶液的配制：將供試品按標示量復溶后，用7%DMEM培養液稀釋成約1 000 IU/ml。在96孔培養板中，以4倍稀釋度做梯度稀釋，共8個稀釋度，每個梯度做2個復孔。③將②項配制的標準品溶液和供試品溶液加入接種WISH細胞的培養板中，每孔 100 μl，于 37℃、5%CO2條件下培養 18～24 h。 ④制備病毒液與攻毒：取-70℃凍存的VSV用2%DMEM攻毒培養液稀釋至100TCID50。吸棄細胞培養板的上清，將稀釋好的病毒液加入培養板中，每孔 100 μl，37℃、5%CO2培養 24 h。⑤鏡檢標準溶液的50%病變點在1 IU/ml，即為F行。然后棄去細胞培養板中的上清液，每孔加入50 μl結晶紫染色液，室溫放置30 min后，用水盆盛上純化水，換水漂洗培養板3次，并在吸水紙上輕叩幾下，然后每孔加入100 μl脫色液，室溫放置5～10 min。用微量振蕩器振蕩混勻1～2 min，然后于波長540 nm處測定。根據樣品稀釋倍數計算實驗測定結果。

1.3.2 方法二[1-3]此方法中①～④與方法一中相同。⑤每孔加入 0.5%MTT 溶液 20 μl， 于 37℃、5%CO2條件下培養 5 h，然后每孔加入100 μl裂解液，于37℃、5%CO2條件下培養過夜，用微量振蕩器振蕩混勻1～2 min，然后于波長540 nm處測定。根據樣品稀釋倍數計算實驗測定結果。

2 結果

2.1 方法一測定結果

見表1。

表1 方法一測定結果（107IU/ml）

方法一總平均值為1.916×107IU/ml，所有測定值間的RSD為15.0%。

2.2 方法二測定結果

見表2。

表2 方法二測定結果（107IU/ml）

方法二總平均值為1.887×107IU/ml，所有測定值間的RSD為11.8%。

2.3 方法一每次測定的r值

見表3。

表3 方法一每次測定的r值

2.4 方法二每次測定的r值

見表4。

表4 方法二每次測定的r值

3 討論

由表1、2可以看出，兩種方法平均值偏差不大，方法一單次測定結果之間偏差較大，r值較小；方法二單次測定結果之間偏差較小，r值較大。由此可以看出，方法二測定的結果準確性較高。

實驗所用WISH細胞株的生長狀態、鋪板細胞數目、VSV滴度以及病變終止時間的確定等因素都會影響實驗結果，尤其是病變終止時間的確定存在個人主觀偏差。為了保證實驗結果的良好重復性，需要嚴格保持實驗條件的一致性。

目前測定干擾素活性更為靈敏的方法還有ELISA檢測法和LDH釋放法[4-5]等，更為客觀的方法正在摸索中，希望不久能夠建立更為靈敏的檢測方法。

[1]國家藥典委員會.中國藥典[S].三部.北京:化學工業出版社,2005:附錄56-57,附錄59.

[2]黃志榮.MTT比色法在干擾素生物學活性測定中應用的探討[J].海峽藥學,2006,18(6):60-61.

[3]伊春德,金伯泉,黃傳書.應用MTT法測定IFN的生物活性效價[J].上海免疫學雜志,1999,10(4):247.

[4]程偉,顧瑛,李新元,等.用LDH釋放法判斷細胞病變程度確定干擾素生物活性[J].軍醫進修學院學報,1999,20(4):295-297.

[5]何金生,宗庭益.LDH釋放法檢測NK細胞活性的方法學研究[J].中國實驗臨床免疫學雜志,1996,8(2):10-13.