藏靈菇發酵乳中乳酸菌的分離純化與鑒定

黃 穎,杜 娜,張,鄭永晨*

藏靈菇是一種乳白色、膠質狀的塊狀物(由微生物產生的胞外多糖與乳蛋白聚合而成),外形酷似米粒,上面棲息著多種微生物,經過長期在牛奶中培養,個體會增大很多,形狀如盛開的雪蓮,所以有人稱之為“西藏雪蓮”[1]。藏靈菇是一種天然的乳品發酵劑,有良好的發酵特性,用它制作的酸奶與傳統的酸奶或用其它純種乳酸菌發酵劑制成的產品有很大的不同,最顯著的特征是除乳酸發酵外,還伴有輕微的由酵母菌引起的酒精發酵,是一種集酸、乙醇味于一體的新型發酵乳制品,將其作為乳品家族的一個新品加以開發,具有很好的市場前景。目前這種產品都是以藏靈菇為發酵劑進行制作,由于藏靈菇上微生物的組成比較復雜,用發酵劑傳代的方法進行擴大生產,極易發生菌相失衡,使發酵乳的風味和品質發生變化,失去原有的優良特征,限制了它的工業化生產[2]。本研究對藏靈菇發酵乳中益生菌進行了分離和鑒定,以期為藏靈菇發酵工業中的發酵劑純培養研究和產業化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 藏靈菇由吉林農業大學食品微生物教研室提供。培養基:MRS培養基,光明乳業無抗生素純牛奶。

1.2 方法

1.2.1 藏靈菇發酵乳的制備 藏靈菇用無菌水沖洗后,按2%(W/V)的比例接種到純牛奶中,30℃培養24 h,過濾出藏靈菇,再次加入到純牛奶中培養24 h。如此連續活化3次,最后一次發酵乳濾液留備試驗用。

1.2.2 乳酸菌的分離與純化 藏靈菇發酵乳濾液1 ml,用無菌生理鹽水以10倍稀釋法稀釋至10-5、10-6、10-7倍的稀釋菌懸液。分別從上述2種菌懸液中選擇3個最高稀釋度,每個稀釋度取0.1 ml,分別涂布于MRS平板,37℃培養48-72 h,然后挑取不同形態的典型菌落制片,革蘭氏染色觀察并進行接觸酶試驗。凡屬革蘭氏陽性菌兼接觸酶陰性的菌落繼續在原培養基上劃線純化,重復 2-3次,直至鏡檢為純培養物止。純化后的菌株接種至MRS斜面上培養,培養后至4℃冰箱中保存備用。

1.2.3 乳酸菌的生理生化鑒定 包括明膠液化試驗、石蕊牛乳試驗、吲哚試驗、淀粉水解試驗、產硫化氫試驗、硝酸鹽還原試驗、產黏液試驗及糖發酵試驗等[3]。

1.2.4 細菌 DNA的提取及16S rRNA的PCR擴增[4]細菌DNA的提取采用酚-氯仿法,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測細菌DNA。以提取到的細菌DNA為模板,利用 Taq酶及 16S通用引物進行PCR擴增。PCR反應條件為:95℃5 min;94℃30 s,50℃30 s,72℃1 min,30個循環;72℃15 min;10℃5 min;4℃保存。

1.2.5 16S rRNA序列測定與分析 PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海生工公司測序,序列提交NCBI數據庫,搜索與測序結果相近序列進行比對。

1.2.6 菌株的生物學特性

①生長特性 將分離到的菌種按 3%接種量接種于MRS液體培養基中,37℃厭氧培養,每 2 h測定一次發酵液 OD600和pH。

②耐酸性試驗 將活化3代的分離到的菌種懸液按3%的接種量分別接入pH 2.0和 3.0的MRS液體培養基中,37℃厭氧培養,分別于0 、30、60、90、120 min進行MRS平板菌落計數。

③耐膽鹽試驗 將活化3代分離到的的菌種懸液按3%的接種量分別接入含0.3%和0.5%膽汁鹽的MRS液體培養基中,37℃厭氧培養,分別于0、2、4 h進行MRS平板菌落計數。

2 結果

2.1 藏靈菇發酵乳中乳酸菌屬種的鑒定

本研究從藏靈菇發酵乳中分離到2株乳酸菌,其形態及部分生理學特性見表1。該2株菌均不運動,均在10℃下生長,45℃不生長,硝酸鹽還原、明膠液化、產硫化氫及淀粉水解試驗皆為陰性,結合糖發酵試驗與16S rRNA測序比對結果,初步確定:LP1為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum);LA1為嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)。

2.2 菌株的生物學特性

2.2.1 生長特性

LP1和LA1的生長曲線和產酸曲線如圖1和圖2所示。由圖1和圖2可知,LA1前8h生長緩慢,10 h后進入對數生長期,18 h后生長處于穩定期。LP1前10 h生長緩慢,12 h后進入對數生長期,20 h后生長處于穩定期。LA1產酸速度開始較快,8 h后pH就降至5以下,產酸平穩,pH基本維持在4.0左右。LP1產酸速度較慢,10 h后pH才降至5以下,產酸平穩,pH基本維持在4.2左右。

表1 藏靈菇發酵乳中乳酸菌鑒定結果

圖1 LA1的生長曲線和pH值變化

圖2 LP1的生長曲線和pH值變化

2.2.2 耐酸性實驗

在120 min的培養過程中,pH 2時,LP1和LA1的生長均受到不同程度的抑制,30 min后LP1的活菌數開始明顯下降,90 min后LA1的活菌數也迅速下降,120 min時,LA1的活菌數尚能維持在104cfu/ml水平,LP1僅達102cfu/ml,可見LA1的耐酸能力較LP1強。pH 3和4時,兩株菌的活菌數在120 min雖都有所下降,仍可維持一個較高水平。

表2 菌株的酸耐受性能(活菌數log cfu/ml)

2.2.3 耐膽鹽實驗

在含膽鹽濃度(m/v)為0.3%的液體MRS中培養4 h后,與不含膽鹽的空白組相比,兩株菌活菌數略有下降,但仍保持在107cfu/ml,活菌數差異并不顯著。相對而言,0.5%牛膽鹽對菌株的抑制作用稍強,在培養4 h后,LP1和LA1活菌數分別維持在104cfu/ml和106cfu/ml,LA1耐膽鹽能力較強。

3 討論

目前國內一些地區流行飲用藏靈菇浸泡奶,實質上是利用藏靈菇作為發酵劑,發酵牛奶。藏靈菇中微生物較普通酸奶發酵劑復雜,除含乳酸菌外,還含有酵母菌。現在對藏靈菇的研究,僅僅是從藏靈菇中分離出部分菌株,對藏靈菇中微生物的種群結構及發酵過程中的優勢微生物缺乏了解,因而對藏靈菇作為發酵劑的發酵機理及其發酵奶所具有的保健效果不能做出科學的解釋,使得藏靈菇在民間一直保持著神秘色彩。

表3 菌株的膽鹽耐受性能(活菌數log cfu/ml)

本研究從藏靈菇發酵乳中分離到兩株乳酸菌,對分離得到的兩株乳酸菌進行了生理生化和16S rDNA序列同源性分析,并結合形態學特征確定這兩株菌分別為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)和嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)。

由于乳酸菌必須進入人體的胃腸道才能發揮其功能,因此要求乳酸菌能耐受有機體的防御機制,其中包括胃液中的低pH和小腸中的高膽鹽等[5]。生物學特性結果顯示,LA1和LP1在pH 2.0和膽鹽濃度為0.3%、0.5%的MRS培養基中分別培養2 h和4 h后,活菌數基本上仍可達到104cfu/ml,以上,表明具有較好的耐酸和耐膽鹽能力。

藏靈菇是個復雜的微生物共生體系,其中應該還包括一些因試驗條件所限而未分離出來的菌株,有待進一步深入研究。

[1]劉變芳,孔慶學,郭藹光.自然發酵劑“西藏雪蓮”的初步研究與菌種鑒定[J].中國釀造,2004,11(11):11

[2]周劍忠,董明盛,江漢湖.PCR-DGGE指紋技術與分離技術結合篩選藏靈菇發酵過程的優勢菌[J].中國農業科學,2006,39(8):1632.

[3]東秀珠,蔡妙營.常見細菌系統鑒定手冊[M].北京:科學出版社,2001.

[4]Giraffa G,Rossetti L,Neviani E.An evaluation of chelex-based DNA purification protocols for the typing of lactic acid bacteria[J].Journal of MicrobiologicalMethods,2000,42:175.

[5]辛 羚,郭本恒,吳正鈞.3株乳桿菌在模擬消化環境中存活性能的研究[J].中國乳品工業,2005,33:15.