肝病實驗室診斷

徐京昕

(北京大學醫院 檢驗科,北京100871)

1 肝臟結構功能特點及肝病實驗室診斷技術

1.1 肝臟結構功能特點

肝臟具有生物合成、生物解毒、排泄和免疫功能。肝臟有肝動脈和門靜脈雙重血液供應,有豐富的血竇,有兩條輸出通路-肝靜脈和膽道系統,肝細胞內含有數百種酶。可引起肝炎的病毒有甲、乙、丙、丁 、戊 、庚型肝炎病毒(HAV、HBV、HCV、HDV、HEV、HGV)。

1.2 肝病實驗室檢測技術

生化技術:酶促速率分析法、干化學法、層析技術、光譜技術、色譜技術和質譜技術。免疫標記技術:酶免分析法、化學發光法、電化學發光法、熒光標記法和放免技術、流式細胞技術、時間分辨技術。分子生物學技術:PCR、雜交和生物芯片技術(基因芯片技術、蛋白芯片技術)。

2 實驗室檢測項目的臨床應用

2.1 生化指標的臨床應用

指示肝實質細胞膜通透性病變試驗:丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、亮氨酸氨基肽酶(LAP)、乳酸脫氫酶(LDH)、腺苷脫氨酶(ADA)等活性增高。

指示肝細胞壞死試驗:谷氨酰脫氫酶(GDH)、AST/ALT增高。

指示肝內或肝外膽道阻塞試驗:堿性磷酸酶(ALP)、L-γ-谷氨酰基轉移酶(GGT)、LAP 、5′-核苷酸酶(5′-NT)、膽汁酸(TBA)增高。

指示肝實質細胞內質網蛋白合成機制障礙試驗:總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、前白蛋白(PA)、膽堿酯酶(ChE)、凝血因子、纖維蛋白元(FIB)下降。

指示肝臟間質成分增生試驗:蛋白電泳球蛋白增加、纖維化指標β-N乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)和血清單胺氧化酶(MAO)增高。

指示肝臟惡性疾病試驗:ALP、GGT-II、LDH、甲胎蛋白(AFP)、α-L-巖藻糖苷酶(AFU)增高。

2.1.1 肝病出凝血實驗室指標-凝血因子 肝臟疾病,最多和最先減少的是因子VII,其次和中度減少的是因子II和Ⅹ,最后和最少減少的是因子V。

2.1.2 肝臟分泌功能指標-膽汁酸(TBA)TBA的測定,對肝膽疾病的診斷其敏感性達76%,特異性達93%。TBA測定對急性肝炎早期診斷的價值與ALT和AST測定相同,但ALT和AST隨肝細胞損害的控制很快轉為正常,而TBA則逐漸轉為正常。TBA持續較高水平的患者往往慢性歸轉。TBA測定對檢測酒精或工業化學品引起的肝細胞損傷的靈敏度優于其他肝功能試驗。此外,TBA測定對肝外膽管阻塞和肝內膽汁淤積的診斷具有較高的靈敏度,包括膽管阻塞、膽汁性肝硬化、新生兒膽汁淤積和妊娠性膽汁淤積。

2.1.3 肝臟解毒功能指標-膽紅素(BIL)肝損傷時,影響了肝臟對膽紅素的攝取、轉化、排泄功能,造成血中結合與未結合膽紅素均增加-黃疸。病毒性肝炎、中毒性肝炎或肝癌、肝內或肝外膽道阻塞、新生兒生理性黃疸等膽紅素增高。肝臟對膽紅素和膽汁酸有不同的運轉系統,可鑒別膽汁淤滯和高膽紅素血癥。

2.1.4 肝臟合成功能指標-TP、ALB和PA 肝臟功能嚴重損害時,蛋白質合成減少,以白蛋白的下降最為顯著。PA是肝功能障礙的一個敏感指標,對肝病的早期診斷有一定的價值。

2.1.5 肝病酶學實驗室指標 肝細胞血清酶活性異常機制:細胞及細胞器受損,酶外溢;肝細胞合成功能降低,酶合成量減少;膽道排泄受阻,造成酶堆積;癌細胞逆向合成活躍,某些酶蛋白合成增加。常用指標:ALT、AST、ChE、ALP、GGT。新應用指標:GDH 、ADA 、LAP、5′-NT 、AFU 、MAO 。

①轉氨酶臨床意義 ALT和AST在傳染性肝炎、肝癌、中毒性肝炎、脂肪肝和膽管炎時都增高,可用于判斷病情,輔助鑒別診斷,并可監控療效及判斷預后。

②ChE臨床意義 ChE在肝實質細胞損害時由于合成減少而降低,對早期肝硬化診斷有價值,對病毒性肝炎預后也有意義。

血清酶在各種肝病中的活性(U/L)

③ALP臨床意義 ALP是肝膽疾病的臨床輔助診斷指標,在阻塞性黃疸、急性或慢性黃疸性肝炎、肝癌時都增高。

④GGT臨床意義 GGT主要診斷肝膽疾病。原發性肝癌、胰腺癌和乏特壺腹癌時,GGT顯著增高,特別在診斷惡性腫瘤患者有無肝轉移和肝癌術后有無復發時,陽性率可達90%。但作為肝癌標志物的特異性較差,急性肝炎、慢性肝炎活動期、阻塞性黃疸、膽道感染、膽石癥、急性胰腺炎時都可增高。

⑤LDH臨床意義 LDH常用于心肌梗死、肝病和某些惡性腫瘤的臨床診斷。

⑥ADA臨床意義 ADA活性增高,常見于肝炎、肝硬化、腫瘤引起的阻塞性黃疸。

⑦MAO臨床意義 MAO活性測定是檢查肝纖維化病變的重要指標。MAO-Ⅰ活性增高主要見于肝硬化和肢端肥大癥,而MAO-Ⅱ活性增高主要見于大塊肝壞死。爆發性肝炎、重癥肝細胞壞死時,線粒體的MAO釋放,血液中酶活性增高,陽性率可達73%以上。

⑧5′-NT 臨床意義 5′-NT 活性增高主要見于肝膽系統疾病,如阻塞性黃疸、原發及繼發性肝癌等。通常酶活性變化與ALP活性變化相平行。在骨骼系統疾病中,通常ALP增高,而5′-NT正常,測定5′-NT有助于臨床判斷ALP增高原因是肝膽系統疾病,還是骨骼系統疾病。

⑨NAG臨床意義 NAG在肝硬化和慢性活動性肝炎晚期,肝組織有纖維化時增高,中晚期妊娠時亦見增高。

⑩AFU臨床意義 慢性肝炎和肝硬化患者AFU增高,但一般僅輕度增高,且隨疾病的治愈和好轉而下降。原發性肝癌(PHC)患者AFU持續升高,幅度較大。AFU不僅顯著高于正常對照,也顯著高于轉移性肝癌、膽管細胞癌、肝硬化、先天性肝囊腫和其他良性肝占位性病變。AFU的敏感性高于甲胎蛋白(AFP),特異性差于AFP,AFU與AFP無起明顯相關,二者聯合檢測可提高肝癌的檢出率,特別是對AFP陰性和小細胞肝癌的診斷價值更大。AFU還可作為PHC術后監測、追蹤觀察的較理想指標,其變化與病情嚴重程度相平行,且早于臨床表現1-2個月。

2.1.6 肝昏迷指標-氨 正常情況下,氨在肝臟內轉變成尿素,嚴重肝臟疾病時,氨不能從循環中清除,引起血氨增高。高血氨有神經毒,引起肝性腦病。血漿氨測定主要用于肝昏迷的監測和處理。

2.2 病毒性肝病病原學檢測項目的臨床應用

病毒性肝病病原學指標:抗原抗體檢測:HAVHGV抗原抗體。病毒核酸檢測:HBV DNA、HCV RNA、HGV RNA。病毒基因分型與突變:HBVYMDD變異、HCVRNA分型。

2.2.1 甲型肝炎病原學檢測意義 抗HAV-IgM陽性是早期診斷甲型肝炎的指標,表示急性期(感染初期,3個月后滴度下降,6-8個月已不易檢出);抗HAV-IgM陰性而抗HAV-IgG陽性提示既往感染HAV。急性期和恢復期雙份血清抗HAV總抗體滴度升高≥4倍;血清或糞便中檢出HAV RNA。

2.2.2 乙型肝炎病原學檢測意義 HBsAg由S基因編碼,是HBV的衣殼蛋白,包括S、前S1和前S2蛋白,是HBV感染的主要標志。是急性乙型病毒性肝炎第一個出現的標志物,HBsAg陽性小于6個月為急性肝炎、大于6個月為慢性肝炎。極少數情況下,“a”決定族的變異株可以逃逸抗HBs抗體的檢測,可能造成假陰性漏檢。

抗HBs陽性一般表示病毒已清除。但已有報道抗HBs出現后血清內仍有DNA復制,尤其急性乙型肝炎感染窗口期抗HBs與HBV DNA同時陽性,但通常HBV DNA檢出率逐步下降。是HBV疫苗免疫后唯一出現的指標。

HBeAg由C基因編碼,是HBV核心的可溶性抗原,HBeAg陽性表示病毒在體內復制,傳染性較強。HBeAg陽性與HBV DNA有顯著相關和HBsAg差不多同時出現。HBeAg陰轉往往是HBV病毒血癥的消失或炎癥的靜息。一般認為HBeAg消失和抗HBe出現是乙型慢性肝炎好轉穩定的征象,但并不意味著HBV DNA停止復制或傳染性消失,尤其在另一部分感染者中如重型肝炎患者,主要以HBcAg的表達為主,感染起始即為HBeAg陰性。HBeAg向抗HBc抗體轉換是抗病毒藥物療效評價指標。

抗HBc是HBcAg的相應抗體,是HBV感染后血清中最早出現的標志性抗體,幾乎所有個體在接觸HBV后都能產生抗HBc,是流行病學調查的良好指標。接觸HBV抗原者,血清中可出現低滴度抗HBc抗體,只有進行連續檢測,抗體滴度逐漸升高,或抗體滴度達10000以上時,抗HBc才可作為感染指標。抗HBc有IgG、IgM、IgA三類,IgM類和IgA類抗HBc在乙肝急性期或慢性肝炎活動期出現。在HBV感染的“窗口期”,抗HBc常常是唯一可測出的HBV血清標志物。

HBV DNA與HBV感染者病情和預后的關系密切,尤其是急性和慢性乙型肝炎患者,是目前病毒檢測的金標準。HBV DNA陰性提示外周血中已經沒有病毒存在,在抗HBs和抗HBc陽性的某些病例中可檢測到HBV DNA的存在。HBV DNA一直保持較高水平的急性肝炎患者易慢性化,而HBV復制水平較高的慢性肝炎患者不僅對干擾素治療的反應性差,而且肝組織炎癥反應更明顯,病情更重,更易發生肝硬化和肝癌。中國慢性乙肝病人治療的目的主要就是降低血清HBV DNA,同時HBV DNA滴度的動態變化還可在臨床上用于觀察抗病毒藥物療效,指導用藥。

2.2.3 丙型肝炎病原學檢測意義 我國輸血后肝炎中60%-80%、散發性急性肝炎中12%-24%為丙型肝炎。人體感染HCV后臨床癥狀一般較輕,但70%-85%患者發展成慢性肝炎,感染20-30年后10%-20%發展成肝硬化,另有1%-5%可發展成原發性肝癌。

血清ELISA檢測抗HCV-IgG抗體:作為篩查和診斷。抗HCV抗體陽性而血清中沒有HCV RNA提示既往感染,有極少數病例抗HCV陰性但可檢測到HCV RNA,還有某些慢性HCV感染者的抗HCV可持續存在。

重組免疫印跡試驗(RIBA)檢測抗HCV-IgG抗體:作為丙肝確認試驗。

HCV RNA定量PCR測定:由于個體間免疫功能的差異,部分患者出抗-HCV較晚,免疫功能低下者和經免疫抑制治療者甚至可能不產生抗-HCV,因此HCV RNA是HCV感染的確診標志,即使在“窗口期”,也可檢測出HCV RNA,還可指導用藥,為療效觀察及預后判斷提供客觀指標。

2.2.4 丁型肝炎病原學檢測意義 丁型肝炎病毒抗原(HDV-Ag):HDV-Ag主要存在于受感染的肝細胞核和胞質內,在血清中出現較早,持續時間僅1-2周,如檢測不及時,往往呈陰性。

抗HDV-IgM:抗HDV-IgM 出現是一過性的,為HDV和HBV同時感染;抗HDV-IgM持續升高或隨肝損傷波動者,為HDV和HBV重疊感染,同時它也是慢性活動性HDV感染的指標。連續檢測抗HDVIgM可估計慢性丁型肝炎的預后。如抗HDV-IgM升高的同時伴有肝功能異常,提示病情惡化。

抗HDV-IgG:抗HDV-IgG一般在感染6周以后出現,慢性感染的發展與抗HDV-IgG的高滴度持續存在有關。該滴度在整個病程中持續不變,是慢性感染的指標。而低滴度的抗HDV-IgG則是HDV既往感染的指標。

HDV RNA:血清HDV RNA是直接證實HDV感染和病毒復制活動的指標,檢測應用發現血清抗HDV-IgM陽性者有較高的HDV RNA檢出率。對各型乙型肝炎患者HDV RNA的檢測,重型肝炎檢出率較高,其次為肝硬化。

2.2.5 戊型肝炎病原學檢測意義 戊型肝炎病毒抗原(HEV-Ag):HEV感染者的糞便或膽汁中可查出HEV-Ag,結合臨床診斷為戊型病毒性肝炎。戊型病毒性肝炎患者糞便的陽性率僅為21%左右。

抗HEV-IgM和抗HEV-IgG:抗HEV-IgG在戊肝急性期即可檢出,且滴度較高,持續約6個月,抗HEV-IgM通常滴度不高,持續約2個月。抗HEVIgM和抗HEV-IgG均陽性,現癥感染期或恢復期早期;抗HEV-IgM陽性,抗HEV-IgG陰性,HEV感染早期、急性期;抗HEV-IgM陰性,抗HEV-IgG陽性,HEV繼往感染或恢復后期。還有17.8%的患者兩種抗體均為陰性。

HEV RNA:血清、膽汁、糞便中檢出HEV是診斷急性戊型肝炎最特異的指標;急性期患者血清的陽性率約為70%左右。

2.2.6 庚型肝炎病原學檢測意義 HGV感染血清標志物主要有特異性HGV抗體(抗-HGV)和HGV RNA。凡ELISA法檢測到抗HGV陽性者,可診斷為現癥或過去已感染過庚肝病毒。

2.2.7 前S蛋白/抗前S蛋白臨床意義 是病毒附著于肝細胞膜上最重要的介導部位蛋白的氨基酸(AA)21-47片段;變異的病毒只要一區段完好就有傳染性;主要存在于血清中完整HBV表面。出現在急性HBV感染的最早期,是病毒清除的最早跡象;前S1病毒蛋白與HBV DNA、HBeAg高度相關;在抗HBe陽性的HBV感染者中,檢出前S1蛋白可表明病毒的復制。

2.3 自身免疫性肝病檢測項目的臨床應用

2.3.1 抗核抗體(ANA)檢測意義 ANA對很多自身免疫性疾病有診斷意義,對慢性活動性肝炎也有20%-50%的檢出率。

2.3.2 抗ENA抗體檢測意義 抗ENA抗體中的抗SS-A/Ro抗體可見于20%的原發性膽汁性肝硬化,偶見于慢性活動性肝炎。

2.3.3 抗組蛋白抗體檢測意義 在非風濕性自身免疫疾病中,原發性膽汁性肝硬化患者約有76%抗組蛋白抗體陽性。

2.3.4 抗線粒體抗體(AMA)檢測意義 靶抗原是真核細胞線粒體膜上的多種蛋白,現知有M1-M9共9種成分。抗M2 AMA對原發性膽汁性肝硬化(PBC)患者的特異性為97%,敏感性為95%-98%。高滴度的抗M2抗體是PBC的標志,但AMA與PBC的病期、疾病嚴重程度、治療效果和預后均無明確關系。抗M2抗體還見于其他慢性肝病,如慢性活動性肝炎(CAH)及 HbsAg陰性的肝病(陽性率為30%),還有進行性全身性硬化癥(陽性率為7%-25%),但均以低滴度為主。

2.3.5 抗肝抗原自身抗體檢測意義 抗肝抗原自身抗體有多種,包括抗肝特異性脂蛋白(LSP)抗體、抗肝細胞膜抗原(LMA)抗體、抗線粒體抗體(AMA)、抗肝腎微粒體(LKM)抗體、抗平滑肌抗體(ASMA)和抗可溶性肝抗原/肝胰抗原(SLA/LP)抗體等。這些自身抗體在區分病毒性肝炎及三型自身免疫性肝炎(AIH)中具有重要意義。如Ⅰ型AIH可檢測到ANA和抗LMA抗體;Ⅱ型AIH的特征性抗體是抗LKM-1抗體;Ⅲ型AIH的特征性抗體是抗SLA/LP抗體。

2.3.5.1 抗肝特異性脂蛋白(LSP)抗體檢測意義陽性主要見于急性、慢性病毒性肝炎和慢性活動性自身免疫性肝炎。該抗體在不同人群中的陽性率如下:自身免疫性肝炎活動期為50%-100%;急性病毒性肝炎為11%-93%;慢性病毒性乙型肝炎為28%-93%;慢性病毒性丙型肝炎為0%-10%;隱匿性肝硬化為20%-38%;原發性膽汁性肝硬化為33%-51%;酒精性肝病為0%-36%;其他肝病為0%-17%;非肝性自身免疫疾病為0%-18%。

2.3.5.2 抗肝細胞膜抗原(LMA)抗體檢測意義抗LMA抗體在不同人群的陽性率為:在Ⅰ型自身免疫性肝炎活動期為35%-100%;急性病毒性肝炎為0%-17%;;慢性病毒性乙型肝炎為0%-16%;隱匿性肝硬化為0%-61%;原發性膽汁性肝硬化為0%-42%;酒精性肝病為0%-27%;其他肝病為0%-4%;非肝性自身免疫病為0%-4%。抗LMA與抗LSP抗體不同,更多見于原發性自身免疫性肝炎患者。可能通過抗體依賴性細胞介導的細胞毒反應和補體介導的細胞毒作用造成肝細胞的損傷。

2.3.5.3 抗肝腎微粒體(LKM)檢測意義 抗LKM-1是Ⅱ型AIH的標志性抗體,也見于2%-10%的慢性丙型病毒性肝炎患者。

2.3.5.4 抗平滑肌抗體(ASMA)檢測意義 SMA為Ⅰ型AIH的標志抗體。在自身免疫性肝病患者中的檢出率可達90%。高滴度的SMA對診斷AIH的特異性幾乎達到100%,低滴度的SMA見于酒精性肝硬化和病毒性肝炎。

2.3.5.5 抗可溶性肝抗原/肝胰抗原(SLA/LP)抗體檢測意義 抗SLA/LP抗體是Ⅲ型AIH最特異的指標。抗LKM/LP抗體陽性的AIH患者ANA、SMA和抗LKM-1多為陰性,其陽性率僅約30%,但其陽性預測值幾乎為100%。

2.3.5.6 抗Sp-100抗體(抗核顆粒抗體)檢測意義

原發性膽汁性肝硬化(PBC)是一種慢性炎性肝病,最初為小到中等大小的膽管發炎,并逐漸轉化為進行性組織病變,最后是嚴重的肝硬化。抗Sp-100抗體可在31%的PBC病人中檢測到,尤其在AMA陰性的PBC病人中,其檢測率為48%,其他的自身免疫性肝病患者此抗體陰性。

2.3.5.7 抗去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)抗體檢測意義 抗ASGPR抗體在AIH陽性率可達50%,治療前或活動期患者可達88%,該抗體可見于各型AIH患者,該抗體水平下降或消失表示治療有效,升高則表示病情復發。

2.3.5.8 抗肝細胞溶質抗原1型(LC-1)抗體檢測意義 抗LC-1抗體為Ⅱ型AIH的特異性抗體,陽性率為56%-72%。多見于小于20歲的患者,大于40歲的患者少見。抗LC-1抗體水平與Ⅱ型AIH患者的疾病活動性密切相關,常與抗LKM-1抗體同時存在,但特異性優于抗LKM-1抗體。

2.4 實驗室檢測項目的臨床應用

2.4.1 急性病毒性肝炎

篩選:ALT、膽紅素。確定病因:HbsAg、抗HbcIgM、抗HAIgM、抗HCV。估計病情和預后:白/球蛋白 、IgG 、IgA、IgM,凝血酶原時間 。

2.4.2 慢性肝炎

篩選 :ALT、AST、ChE、BIL、白/球蛋白 、蛋白電泳。確定病因:HbsAg(陽性則HbeAg、抗Hbe、抗HbcIgM)、抗 HCV、抗HDV、抗平滑肌抗體、抗核抗體。估計病情和預后:免疫球蛋白、凝血酶原時間。

2.4.3 肝纖維化實驗室指標

膠原:III型前膠原肽;III型前膠原;IV型膠原;I型膠原;IV膠原肽。肽酶:脯氨酸羥化酶、脯氨酸肽酶。非膠原蛋白:層粘連蛋白;透明質酸。細胞因子:血小板衍生生長因子-BB(PDGF-BB)、轉化生長因了 β、TGF-β、GTGF 結締組織生長因子 、TNF 和INF。

2.4.4 肝硬化

血清蛋白成分的異常;血清膽紅素升高;血清酶學指標的改變;凝血酶原時間延長、活動度降低。

2.4.5 原發性膽汁性肝硬化

篩選:ALT、BIL、ALP、IgM 。確診:抗線粒體抗體(M2)、肝活檢。

2.4.6 原發性肝癌

篩選:AFP、ALP-Ⅰ、γ-GT同工酶Ⅱ。其他癌指標:鐵蛋白、α-1抗胰蛋白酶、異常凝血酶原。