丙泊酚對大鼠海馬ERK1/ERK2和CREB磷酸化水平的影響

張 英,陳 鵬,鄭利民

(1.北京大學深圳醫院麻醉科,廣東 深圳518036;2.吉林大學中日聯誼醫院 麻醉科,吉林 長春130033)

細胞外信號調節激酶(ERK)是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,是傳遞絲裂原信號的信號轉導蛋白。在對學習記憶相關的行為學實驗以及LTP的誘導和維持的研究中發現,應用阻滯劑抑制ERK1/2的激活后,海馬LTP的誘發被抑制[1],小鼠水迷宮空間學習記憶能力[2,3]和大鼠條件性恐懼的學習記憶能力[4,5]均被削弱,因此,ERK1/2信號通路的激活與LTP和學習記憶功能密切相關。進一步的研究表明,ERK1/ERK2信號轉導通路的激活參與了短時記憶形成和短時記憶向長時記憶的轉化即記憶的鞏固過程[6,7]。cAMP反應元件結合蛋白(CREB)是轉錄/翻譯因子家族的一員,其磷酸化水平的增加參與了長時程增強(LTP)的維持和長時記憶形成[7,8]。丙泊酚(2,6-二異丙酚)是一種高效能的經典靜脈麻醉劑,在臨床上廣泛用于全身麻醉誘導、維持和局部麻醉及重癥監護病房患者的鎮靜。與其他靜脈麻醉劑一樣,除了鎮靜、催眠和麻醉作用外,丙泊酚還具有遺忘作用[9-11]。其明確的順行性遺忘作用有助于避免和減少恐懼記憶的獲得和存儲,從而可以減少患者圍手術期精神創傷和術后認知功能障礙的發生機率,其機制是否與ERK1/ERK2和CREB的磷酸化水平有關尚未定論。本研究擬評價丙泊酚對大鼠海馬ERK1/ERK2和CREB的磷酸化的影響,探討丙泊酚順行性遺忘作用的機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器 丙泊酚(10 mg/ml,批號:GF045,AstraZeneca S.p.A公司,意大利)。磷酸化ERK1/ERK2(p-ERK1/ERK2)多克隆兔抗體、ERK1/ERK2多克隆兔抗體和磷酸化CREB(p-CREB)多克隆兔抗體及CREB多克隆兔抗體(一抗,Cell Signaling,美國),β-actin多克隆兔抗體(一抗,北京中杉金橋生物技術有限公司),辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔IgG抗體(二抗,北京中杉金橋生物技術有限公司),ECL化學發光試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司),Alpha ImagerTM2200圖像分析處理系統(Alpha Innotech公司,美國),考馬斯亮藍G-250(上海化學試劑公司),其他化學試劑均為國產分析純,用雙蒸水配制,調pH值至7.4。DBA-2大鼠避暗程序自動控制儀(中國醫學科學院藥物研究所)。

1.2 動物選擇與分組 健康成年雄性SD大鼠80只,體重250-300 g,由廣東省醫學實驗動物中心提供。實驗前適應環境1周,室溫22℃-25℃,明暗周期12 h/12 h,濕度50%-60%,自由飲食。隨機分為2組(n=40),對照組和咪達唑侖組。咪達唑侖組于訓練前15 min腹腔注射咪達唑侖3 mg/kg,容量為2 ml/kg,對照組注射等容量生理鹽水。

1.3 認知功能的測試 采用避暗箱實驗測試大鼠認知功能。將避暗箱鏈接DBA-2避暗程序自動控制儀。該儀器分明暗兩室,明室為透明的樹脂材料,明室上方10 cm固定一25 W鎢絲燈照明,暗室為黑色不透明的樹脂材料,明暗兩室中間有一直徑6 cm的圓形滑門。明暗兩室底部為直徑6 mm的銅柵,暗室箱底交流電壓為36 V,電流為1.5 mA。首先對大鼠進行訓練,將其置于明室背對滑門,60 s之后將門打開,當大鼠進入暗室后(即大鼠的四肢全部進入暗室)給予其足部電擊使其逃回明室,直至大鼠不再鉆入暗室,記錄100 s內大鼠不再鉆入暗室所需的訓練次數,在明室停留時間超過100 s認為大鼠對電擊刺激形成了記憶。于訓練結束后1、3、24 h(T1-3)時測試其記憶能力,只給予燈光刺激,當大鼠進入暗室后不給予足部電擊刺激,記錄大鼠在明室停留的時間即記憶潛伏期,當大鼠在明室停留時間超過600 s認為其記憶保持牢固,沒有發生遺忘。

1.4 p-ERK1/ERK2和p-CREB表達的測定 各組于給藥后15 min(T0)和T1-3記憶能力測試結束后,各斷頭處死8只大鼠,冰皿上分離海馬,液氮凍存備用。取凍存的海馬組織,加入裂解液,冰上勻漿,超聲破碎,4℃下15 000 r/min離心15 min,取上清液,BCA法測定蛋白濃度。取50 μ g蛋白上樣,10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離,電泳條件:恒壓,積層膠60 V,分離膠100 V。電泳結束后進行蛋白質轉膜,轉膜條件:硝酸纖維素膜(NC),恒流,電流100 mA,冰上轉膜4 h。印跡膜在含 5%脫脂奶粉的TTBS緩沖液中封閉1 h,TTBS漂洗3次,每次5 min,分別與 ERK1/ERK2及 p-ERK1/ERK2一抗(1∶1 000)、CREB 及p-CREB 一抗(1∶500)和β-actin一抗(1∶1 000)進行雜交反應,4℃過夜,TTBS漂洗 3次,每次5 min。再將NC膜與HRP標記的山羊抗兔二抗(1∶5 000)室溫下搖床雜交反應1 h,再用TTBS漂洗3次,每次5 min,加入 ECL試劑反應1 min后,保鮮膜包裹,暗室進行X線膠片曝光、顯影和定影。X線底片曝光顯影所示條帶放入Alpha ImagerTM 2200圖像分析處理系統,利用Alpha Ease 40軟件進行光密度掃描分析。以ERK1/ERK2和CREB吸光度值與β-actin吸光度值之比表示ERK1/ERK2和CREB的表達,以 p-ERK1/ERK2和 p-CREB吸光度值與ERK1/ERK2和CREB吸光度值之比表示p-ERK1/ERK2和p-CREB的表達。

1.5 統計學處理 采用SPSS13.0軟件進行分析,正態分布的計量資料以均數±標準差(±s)表示,組內比較采用單因素方差分析,組間比較采用成組t檢驗;偏態分布的計量資料以中位數(四分位數間距)[M(Q)]表示,組內和組間比較采用秩和檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 丙泊酚組大鼠不再鉆入暗室所需的訓練次數3(1.25)較對照組1(0.25)增加(P＜0.01)。與T1時比較,生理鹽水組其它時點記憶潛伏期差異無統計學意義(P＞0.05),丙泊酚組其它時點記憶潛伏期縮短(P＜0.01);與生理鹽水組比較,丙泊酚組T2,3時記憶潛伏期縮短(P＜0.01),見表1。

2.2 兩組大鼠各個時點海馬ERK1、ERK2和CREB的表達均無差異(P＜0.05),見表2。

表1 兩組大鼠訓練結束后各時點記憶潛伏期的比較[s,n=8,M(Q)]

2.3 與T0時比較,生理鹽水組T1-3時p-ERK1,p-ERK2和p-CREB表達上調,丙泊酚組T1,2時p-ERK1表達上調,T3時p-ERK1表達下調,T1-3時p-ERK2水平上調,T2時p-CREB水平上調;與生理鹽水組比較,丙泊酚組T2,3時p-ERK1表達下調,T0-3時 p-ERK2和p-CREB表達下調(P＜0.01),見表3。

表2 兩組大鼠各時點海馬ERK1、ERK2和CREB表達的比較(n=8,±s)

表2 兩組大鼠各時點海馬ERK1、ERK2和CREB表達的比較(n=8,±s)

指標 組別 T0 T1 T2 T3 ERK1 group S 0.87±0.08 0.86±0.06 0.87±0.09 0.88±0.10 group P 0.86±0.11 0.84±0.11 0.85±0.08 0.89±0.07 ERK2 group S 0.97±0.09 1.00±0.06 0.99±0.10 1.04±0.09 group P 0.97±0.09 0.99±0.12 1.03±0.03 1.04±0.10 CREB group S 1.01±0.08 1.02±0.10 1.01±0.11 1.02±0.10 group P 1.04±0.10 1.03±0.14 0.99±0.08 1.02±0.12

表3 兩組大鼠各時點海馬 p-ERK1、p-ERK2和p-CREB表達的比較(n=8,±s)

表3 兩組大鼠各時點海馬 p-ERK1、p-ERK2和p-CREB表達的比較(n=8,±s)

與生理鹽水組比較,*P＜0.01;與T0時比較,#P＜0.05

指標 組別 T0 T1 T2 T3 p-ERK1/ERK1 group S 0.63±0.06 0.77±0.05# 0.78±0.08# 0.83±0.07#group P 0.54±0.10 0.77±0.05# 0.63±0.04*# 0.45±0.04*#p-ERK2/ERK2 group S 1.29±0.12 2.99±0.17# 2.99±0.39# 2.21±0.15#group P 0.90±0.07* 1.28±0.17*# 1.21±0.10*# 1.01±0.08*#p-CREB/CREB group S 0.89±0.06 1.74±0.12# 1.97±0.19# 1.59±0.14#group P 0.33±0.06* 0.31±0.07* 0.51±0.06*# 0.30±0.04*

3 討論

本研究采用大鼠連續多次明暗被動回避性條件反射實驗,觀察丙泊酚對條件性恐懼記憶獲得和存儲的影響,該法簡單易行,對記憶過程,特別是對傷害性刺激所產生的恐懼記憶的再現有較高的敏感性[12]。研究表明,丙泊酚的遺忘作用與其鎮靜作用關系并不密切[13,14],大鼠在小劑量(9-25 mg/kg)條件下主要影響記憶功能表現為比較明確的遺忘作用,不影響運動能力和情感,因此本研究選擇丙泊酚的劑量為9 mg/kg,結果表明,與生理鹽水組比較,丙泊酚組不再鉆入暗室所需的訓練次數增加,T2,3時記憶潛伏期縮短,且都小于600 s,提示訓練前腹腔注射丙泊酚9 mg/kg破壞了大鼠被動回避恐懼條件的學習能力,縮短了恐懼記憶的存儲時間,產生順行性遺忘,與以往的文獻結果基本一致[9]。本研究結果還表明,丙泊酚在訓練結束1 h后產生順行性遺忘,進一步說明了丙泊酚對短時記憶的形成沒有影響,但抑制了短時記憶向長時記憶的轉化,即記憶的鞏固過程。

本研究結果表明,與T0時比較,生理鹽水組T1-3時 ERK1、ERK2和CREB磷酸化水平均升高,ERK1磷酸化水平持續升高至T3時達峰值,ERK2磷酸化水平在T1,2時達峰值,CREB磷酸化水平于T2時達峰值,這一結果與文獻報道的ERK1、ERK2和CREB在學習記憶行為中的變化基本一致[15],也進一步說明了ERK1、ERK2和CREB參與了長時記憶的形成。ERK1/ERK2通過蘇氨酸和酪氨酸磷酸化后被激活,ERK1/ERK2被激活后發生核轉位可直接激活轉錄因子 Elk-1,后者作用于血清反應元件(SRE),并作為許多即刻早期基因(IEG)的上游DNA序列,啟動IEG的轉錄;ERK1/ERK2也可通過激活核糖體S6激酶(Rsk)來激活轉錄因子CREB,從而作用于cAMP反應元件(CRE),啟動CRE依賴性的轉錄。此外,ERK1/ERK2也可直接磷酸化轉錄因子CREB[7]。可見,ERK1/ERK2磷酸化水平升高后可易化其下游的轉錄翻譯,調節突觸蛋白的分布和功能,在突觸可塑性及記憶形成中發揮重要作用[7,16]。

研究表明,丙泊酚的鎮靜、催眠和遺忘作用與中樞GABA能神經系統的興奮和NMDA能神經系統的抑制均相關[17-20]。研究也證實,丙泊酚對海馬長時程增強(Long-Term Potentiation,LTP)具有抑制作用[21],而且可能與抑制NMDA介導激活的細胞外信號傳導通路(ERK1/2)密切相關[18]。在LTP的誘導過程中,NMDA受體被激活后可激活ERK1/ERK2信號通路,使其下游的轉錄因子Elk、CREB被激活并進一步易化基因的表達[22]。本研究結果顯示,與生理鹽水組比較,丙泊酚組T2,3時p-ERK1表達下調,T0-3時p-ERK2和p-CREB表達下調,丙泊酚產生的順行性遺忘過程海馬ERK1/ERK2和CREB蛋白磷酸化水平僅短暫升高,提示丙泊酚對大鼠明暗被動回避訓練激活的海馬ERK1/ERK2和CREB蛋白磷酸化水平有抑制作用,這進一步證明丙泊酚遺忘作用與抑制ERK1/ERK2通路的激活進而抑制LTP的誘導和維持密切相關。我們在實驗前15 min腹腔注射9 mg/kg的丙泊酚,大鼠學習獲得能力有缺陷,但短時記憶的形成沒有受到影響,這與Trifilieff的研究一致[15]。Trifilieff于被動回避訓練前30 min海馬內微量注射MEK的選擇性阻斷劑U0126,破壞了短時記憶的存儲,與對照組比較,海馬ERK1/ERK2和CREB蛋白無明顯的磷酸化水平升高過程,這一結果與我們在實驗中觀察到的丙泊酚的作用相似,提示丙泊酚可能通過阻斷ERK1/2激活后進一步級聯反應激活CREB,從而抑制了短時記憶向長時記憶的轉化而發生遺忘。ERK1/2信號轉導通路被認為是細胞外多種刺激傳向細胞內的交匯點,CREB是這些激酶級聯的下游靶位,因此,研究多證實阻斷ERK1/2活化的同時也會阻斷CREB蛋白的激活,但外界刺激引起Ca2+進入細胞后,與鈣調蛋白結合也可以通過激活Ca2+/CaM依賴蛋白磷酸化CREB[16],因此,咪達唑侖對大鼠明暗被動回避訓練激活的海馬CREB蛋白磷酸化的抑制作用也可能是與ERK1/2的活化無關,而是直接抑制了CREB的磷酸化。

綜上所述,丙泊酚的順行性遺忘作用可能與抑制大鼠海馬ERK1、ERK2和CREB磷酸化水平相關。

[1]English,JD Sweatt,JD.A requirement for the mitogen-activated protein kinase cascade in hippocampal long term potentiation[J].J Biol Chem,1997,272(31):19103.

[2]Blum S,Moore AN,Adams F,et al.A mitogen-activated protein kinase cascade in the CA1/CA2 subfield of the dorsal hippocampus is essential for long-term spatial memory[J].J Neurosci,1999,19(9):3535.

[3]Selcher JC,Atkins CM,Trzaskos JM,et al.A necessity for MAP kinase activation in mammalian spatial learning[J].LearnMem,1999,6(5):478-90.

[4]Cannich A,Wotjak CT,Kamprath K,et al.CB1 cannabinoid receptors modulate kinase and phosphatase activity during extinction of conditioned fear in mice[J].Learn Mem,2004,11(5):625.

[5]Schafe,GE,Atkins CM,SwankMW,et al.Activation of ERK/MAP kinase in the amygdale is required for memory consolidation of Pavlovian fear conditioning[J].J Neurosci,2000,20(21):8177.

[6]Igaz LM,Winograd M,Cammarota M,et al.Early Activation of Extracellular Signal-Regulated Kinase Signaling Pathway in the Hippocampus is Required for Short-Term Memory Formation of a Fear-Motivated Learning[J].Cell Mol Neurobiol,2006,26(4-6):987.

[7]Thomas GM,Huganir RL.MAPK cascade signaling and synaptic plasticity[J].Neuroscience,2004,5:173.

[8]Bozon B,Kelly,Josselyn SA,et al.MAPK,CREB and zif268 are all required for the consolidation of recognition memory[J].Phil Trans R Soc Lond B,2003,358:805.

[9]Alkire MT,Vazdar janova A,Dickinson-Anson H et al.Lesions of the basolateral amygdala complex block propofol-induced amnesia for inhibitory avoidance learning in rats[J].Anesthesiology,2001,95(3):708.

[10]O'Gorman DA,O'Connell AW,Murphy KJ,et al.Nefiracetam prevents propofol-induced anterograde and retrograde amnesia in the rodent without compromising quality of anesthesia[J].Anesthesiology,1998,89(3):699.

[11]Veselis RA,Reinsel RA,Feshchenko VA,et al.The comparative amnestic effects of midazolam,propofol,thiopental,and fentanyl at equisedative concentrations[J].Anesthesiology,1997,87(4):749.

[12]徐叔云,卞如濂,陳 修,主編.藥理實驗方法學[M].第3版.北京:人民衛生出版社,2005,827.

[13]Veselis RA,Reinsel RA,Feshchenko VA.Drug-induced amnesia is a separate phenomenon from sedation:electrophysiologic evidence[J].Anesthesiology,2001,95(4):896.

[14]Pain L,Angst MJ,LeGourrier L,et al.Effect of a nonsedative dose of propofol on memory for aversively loaded information in rats[J].Anesthesiology,2002,97(2):447.

[15]Trifilieff P,Herry C,Vanhoutte P,et al.Foreground contextual fearmemory consolidation requires two independent phases of hippocampal ERK/CREB activation[J].Learn Mem,2006,13:349.

[16]Silva AJ.Molecular and Cellular Cognitive Studies of the Role of Synaptic Plasticity in Memory[J].J Neurobiol,2003,54:224.

[17]Snyder GL,Galdi S,Hendrick JP,et al.General anesthetics selectively modulate glutamatergic and dopaminergic signaling via site-specific phosphorylation in vivo[J].Neurophamacology,2007,53(5):619.

[18]Kozinn J,Mao L,Arora A,et al.Inhibition of glutamatergic activation of extracellular signal-regulated protein kinases in hippocampal neurons by the intravenous anesthetic propofol[J].Anesthesiology,2006,105(6):1182.

[19]Kingston S,Mao L,Yang L,et al.Propofol inhibits phosphorylation of N-methyl-D-aspartate receptor NR1 subunits in neurons[J].Anesthesiology,2006,104(4):763.

[20]Irifune M,Takarada T,Shimizu Y,et al.Propofol-induced anesthesia in mice is mediated by gamma-aminobutyric acid-A and excitatory amino acid receptors[J].Anesth Analg,2003,97(2):424.

[21]Nagashima K,Zorumski CF,Izumi Y.Propofol inhibits long-term potentiation but not long-term depressionin rat hippocampal slices[J].Anesthesiology,2005,103:318.

[22]Wang JQ,Fibuch EE,Mao L.Regulation of mitogen-activated protein kinases by glutamate receptors[J].Journal of Neurochemistry,2007,100:1.