小肽為配基的親和層析介質純化干擾素α-2a的研究

高利增,王雪梅,王立成,孫曉莉,李 惟,王麗萍,

(1.吉林大學生命科學學院,吉林長春130021;2.首都醫科大學宣武醫院,北京100053;3.吉林大學中日聯誼醫院,吉林長春130033)

干擾素是一類具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調節作用的重要的細胞因子。根據對干擾素基因核酸序列分析結果表明,它于5-10億年前即于生物學細胞中存在。是生物體內一類古老的保護因子。自它發現以來,大量的臨床研究表明,干擾素在抗病毒性疾病和惡性腫瘤以及增強機體免疫調節能力方面有明顯效果[1,2]。而且,隨著分子生物學及DNA重組技術的迅速發展,已經應用基因工程技術為人類抗腫瘤、病毒生產出大量高效的干擾素。制備高純度的重組干擾素通常采用單克隆抗體親和層析的方法[3-5]。

1 材料與方法

1.1 親和層析介質的制備 Sepharose 4B的懸浮:取CNBr活化的Sepharose 4B干粉(1克干粉可得濕樹脂3.5 ml),用1 mM HCl溶解,并立即用1 mM HCl沖洗,每克樹脂需200 ml,抽濾進行,約需15 min。(注:1 mMHCl必須抽濾徹底,盡量減少其存留量,以免影響偶聯反應)。

配體偶聯:取配體溶于Coupling Buffer中,每毫升樹脂需配體的量為5-10 mg,Coupling Buffer用量為5 ml/g(樹脂干粉)。把溶有配體的Coupling Buffer與懸浮完畢的濕樹脂混合,進行偶聯反應,反復振搖,室溫下1 h或4℃過夜。反應完畢后用5倍樹脂體積的Coupling Buffer洗去未反應的配體。掩埋剩余活性位點:將樹脂轉移到0.1MTris-HCl(pH8.0)中室溫反應2 h。樹脂洗滌處理:將上述樹脂洗滌三輪,每輪用高低pH洗滌液交替洗滌,洗滌液用量為樹脂體積的5倍。樹脂處理完畢后,用上樣緩沖液洗滌3次后即可使用。

1.2 親和層析純化干擾素 樹脂的平衡:將樹脂裝柱后用3倍體積的上樣緩沖液平衡。

上樣:將含有一定濃度干擾素的上樣緩沖液上柱,使干擾素與樹脂發生特異性吸附。

非特異性洗滌:用3-5倍樹脂體積的洗滌液洗滌樹脂,去除非特異性吸附的雜質。

特異性洗脫:用1-3倍樹脂體積的特異性洗脫液洗脫,并隨時檢測流出液的蛋白濃度,收集蛋白濃度較高時的流出液。

蛋白純度的鑒定:純化的蛋白經SDS-PAGE和HPLC分析,確定蛋白的純度。

1.3 親和層析介質純化干擾素能力的評估 通過實驗數據分析,得到這種方法純化干擾素的指標,包括蛋白收率、純化容量、純化效率、可行性評估。

2 結果

2.1 親和層析介質的制備

CNBr活化的Sepharose 4B樹脂,與偶聯的六肽配體的用量是10 mg小肽/1 g樹脂。樹脂與配體的偶聯,小肽與蛋白是不同的,一般來說,肽配體的偶聯量要高于蛋白配體,而且偶聯效率也較高。實驗中我們發現,介質的純化能力和容量與偶聯的六肽配體的多少直接相關,在樹脂的量一定時,偶聯的六肽越多,親和層析介質純化干擾素的容量就越大。

在六肽配體與樹脂發生偶聯反應時,將反應前和反應后的反應液在紫外下掃描,檢測小肽的變化,從而確定偶聯效率。實驗中發現,當小肽的用量高達10 mg/g樹脂時,偶聯的效率仍可達99%(圖1),從而說明親和層析介質的制備比較成功。

本實驗所用的六肽配體共有三種構型:L、1D和6D。L構型六肽是從噬菌體六肽庫篩選得到的與干擾素α 2a特異性結合的肽配體。最初將L配體偶聯于磁珠載體用于純化干擾素,但發現這種親和層析介質在反復使用幾次后,純化能力大大下降,經分析認為是在使用過程中六肽配體遭到酶解,為了防止肽配體的降解,于是又合成了1D和6D兩種配體(表1),其依據的理論基礎是肽配體構型改變后,不再是天然存在的L-構型氨基酸,可以抵抗蛋白酶的降解;同時考慮到以磁珠作親和層析載體比較昂貴,不適合工業生產,需要尋找更普遍的材料作載體,因而又從 Phamacia公司購買了 CNBr活化的Sepharose 4B樹脂作載體。實驗中發現這三種小肽與樹脂的偶聯效率相當,說明小肽中氨基酸構型的改變不影響偶聯效率。

圖1 六肽與樹脂的偶聯反應圖譜

表1 三種肽的氨基酸序列

2.2 親和層析純化干擾素

通過分析六肽配體的氨基酸序列,我們發現其氨基酸構成以疏水性氨基酸為主,因而推測六肽配體與干擾素的結合以特異性的疏水相互作用為主,依據疏水相互作用與溶液的體系的鹽濃度相關的原理,我們把實驗條件的摸索重點放在了離子強度方面,同時摸索了最適pH值。

實驗中發現,當上樣緩沖液pH值在6.0-7.5之間變化時,干擾素與樹脂的吸附效率變化不大,所以選擇pH 7.0作為以后最適pH,洗滌液同樣對pH值的變化不敏感,洗脫液在pH 2.5-4.0之間均可將吸附的蛋白洗下,但pH值越小,洗脫效果越好;但是,當上樣緩沖液中PBS的鹽濃度在0.1-2M之間變化時,蛋白的吸附效率變化極為敏感,隨著鹽濃度的升高,蛋白的吸附效率也隨之升高,但非特異性吸附雜志也增加,當洗滌液鹽濃度略低于上樣緩沖液時,洗滌效果非常明顯,洗滌下來的雜質除非特異性吸附的雜質外,還包括一部分干擾素,從而證明六肽配體與干擾素的結合為特異性疏水相互作用;洗脫液在0.1M、pH2.5-4.0之間可將吸附的蛋白洗脫充分。依據上述變化規律我們最后確定的實驗條件是:上樣緩沖液2.0M、pH7.0,洗滌液1.8-2.0M、pH7.0,洗脫液 0.1M 、pH2.5-4.0。

2.3 親和層析介質純化干擾素能力的評估

根據1.2中總結得到的實驗條件,利用此種親和層析介質純化干擾素,干擾素原液是經包含體變性復性后的透析液,經此純化后,蛋白的收率高達85%(圖2)。蛋白純度達90%,HPLC鑒定(圖3)。在純化過程中,對洗滌液和洗脫液中的蛋白進行實時跟蹤監測,流出液中的蛋白變化與預期相符。蛋白純化過程的變化見圖4。

圖2 干擾素α-2a純化結果

圖3 干擾素α-2a純化后的 HPLC

圖4 干擾素α-2a純化的實時監測

3 討論

與制藥工業生產的干擾素相比,用此種方法純化得到的干擾素雖然純度偏低,不能作為藥物使用,但它作為親和層析純化方法,與傳統的純化方法相比,更為快速,簡單方便,所需的步驟較少,蛋白的收率也較高;同時,以小肽作為親和配體,與以單克隆抗體作為配體相比,前者純化獲得產品污染少,不會象單克隆抗體從介質脫落混入產品進而在人體引發抗原抗體反應。總之,以六肽作為親和配體,為純化干擾素提供了一個新的方法,本實驗對此方法進行了初步的探索,為此方法將來的應用打下了基礎。

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