不同濃度游離脂肪酸對大鼠系膜細胞外基質基因表達的影響

魏 明 盧永申 張俊峰 李盼盼

(鄭州大學第五附屬醫院,河南 鄭州 450052)

分別采用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術和酶聯免疫吸附(ELISA)試驗法對系膜細胞外基質Ⅳ型膠原(ColⅣ)、纖維連接蛋白(FN)、轉化生長因子 β1(TGF-β1)mRNA表達和體外培養合成分泌水平進行檢測,旨在探討不同濃度游離脂肪酸(FFAs)對系膜細胞外基質 ColⅣ、FN、TGF-β1mRNA表達的影響以及其在腎小球硬化發病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 RPMI-1640培養基及新生小牛血清(FCS)為美國Gibco產品,軟脂酸(PA)及小牛血清蛋白(d-BSA)為美國 Sigma產品。

1.2 細胞培養 大鼠腎小球系膜(HBZY-1)細胞購于鄭州大學生理教研室,用含 10%FCS、100 U/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素的 RPMI-1640培養液制成單個細胞懸液,接種于100 ml培養瓶內。當 HBZY-1細胞長至 80%融合時,用 0.25%胰蛋白酶消化傳代,取第 11～14代 HBZY-1細胞用于實驗。37℃ 5%CO2100%濕度條件下培養 24 h,使細胞處于對數生長期,換成0.5%FCSRPMI-1640培養液培養 24 h使細胞處于靜止期。

1.3 實驗分組 吸出孔內培養液,加入 PA使終濃度分別為25、100、400 μmol/L d-BSA,實驗重復 3次。

1.4 RT-PCR體系 按上述方法分組給藥,HBZY-1細胞繼續培養 72h,PBS沖洗 3次,加入 1ml Trizol RNA提取液,提取細胞總 RNA。根據 A260/A 280值計算總 RNA濃度。ColⅣ、FN、TGF-β1mRNA的引物序列見表 1。引物由上海生物工程公司合成。在 25μl的反應體系中含引物各 10 pmol/L,2.5μl的10×buffer,1mmol/Ld NTP,1μl Taq酶 ,變性 94℃ 1min,退火57℃ 1min,延伸 72℃ 1 min,35個循環,72℃延伸 2min。

表1 ColⅣ、FN、TGF-β1 m RNA引物序列

1.5 PCR擴增產物電泳 取擴增產物 5μl加載樣緩沖液1μl,在含有 0.5μg/ml溴化乙啶的 2%瓊脂糖凝膠中電泳,標準物為DL2 000Marker。通過法國紫外凝膠成像系統分析電泳帶灰度。

1.6 ELISA法檢測培養上清液 ColⅣ、FN含量 將 5×104/ml HBZY-1細胞接種于 24孔微量板中培養 24 h,使細胞處于對數生長期,換成 0.5%FCS RPMI-1640培養液培養 24 h使細胞處于靜止期。加入軟脂酸 1 ml使終濃度分別為 25、100、400μmol/L d-BSA,繼續培養 72h,實驗重復 3次。

1.7 統計學處理 數據以x±s表示。對于正態分布的變量應用單因素方差分析,偏相關分析用于在其他變量固定的條件下某兩個相關變量相關分析的檢驗;所有統計學處理均使用SPSS10.0軟件進行。

2 結 果

2.1 不同濃度 PA刺激對 HBZY-1細胞 ColⅣ、FN、TGF-β1mRNA表達的影響 以 25、100、400μmol/L PA刺激后,ColⅣ、FN、TGF-β1mRNA表達量均明顯升高,與 0μmol/L對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。ColⅣ、FN、TGF-β1mRNA表達量間兩兩比較差異有統計學意義(均 P＜0.05)。HBZY-1細胞 ColⅣ、FN、TGF-β1mRNA表達量呈濃度依賴性升高,見圖 1和表 2。

圖1 ColⅣ、FN、TGF-β1 mRNA表達

表2 不同濃度 PA對 HBZY-1細胞 ColⅣ、FN、TGF-β1 mRNA表達的影響(x±s)

2.2 不同濃度 PA刺激對 HBZY-1細胞 ColⅣ、FN分泌水平的影響 以 25、100、400μmol/L PA刺激后,ColⅣ、FN分泌水平均明顯升高,與 0μmol/L對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。ColⅣ、FN分泌水平間比較差異有統計學意義(P＜0.05)。PA促進 HBZY-1細胞合成分泌 ColⅣ、FN,并具有濃度依賴性。見表 3。

表3 不同濃度 PA對 HBZY-1細胞 ColⅣ、FN分泌的影響(x±s)

3 討 論

細胞外基質(FN、ColⅣ、TGF-β1)是細胞生存的微環境,廣泛存在各種細胞表面,是構成基底膜的主要成分。在人體的發育、細胞分化與遷移、信號傳導等生理過程和炎癥損傷與修復、免疫應答以及腫瘤轉移病理過程中具有重要功能和作用〔1〕。長期以來,細胞一直是生物界研究疾病的重點。近年來,細胞外基質在疾病的發生中所起的作用越來越受到重視。FFAs與腎小管間質損傷密切相關,是慢性腎臟疾病的一個進展因素。Kamijo等〔2〕報道 FFAs能導致腎小管間質損傷。在腎病綜合征不是由于白蛋白而是由于結合了FFAs的白蛋白引起了腎小管損傷〔3〕。 Thomas等〔4〕通 過 大鼠 模 型研 究 發現,白蛋白 結合FFAs組在巨噬細胞浸潤、細胞凋亡和皮質細胞增殖方面均比白蛋白未結合組顯著。

本研究結果顯示,不同濃度 PA刺激 HBZY-1細胞后,ColⅣ、FN、TGF-β1mRNA表達量均明顯升高,并呈濃度依賴性。提示PA能促進系膜細胞外基質基因的表達。同時還顯示HBZY-1細胞合成分泌 ColⅣ、FN水平也顯著增加,并呈濃度依賴性,表明PA能促進系膜細胞蛋白質的合成。提示FFAs可能是腎小球硬化的一個誘導因素。

總之,在生理情況下腎小球內細胞外基質的合成和降解保持動態平衡,以維持正常的生理功能。當某些病理因素(糖尿病、腎病等)致FFAs增多,導致細胞外基質合成增加或降解減少,造成細胞外基質成分積聚,使細胞外基質的大量堆積引起腎小球硬化發生、發展。

1 潘 琳,李光偉,郭艷茹,等 .細胞外基質纖維連接蛋白和層黏連蛋白在糖尿病大鼠 DR微血管病變表達的研究〔J〕.中華糖尿病雜志,2004;12(1):56-8.

2 Kamijo A,Sugaya T,Hikawa A,et al.Urinary fatty acid bound to albumin aggravate tubulointerstitial damage〔J〕.Kindney Int,2002;62(12):1628-37.

3 Kamijo A,Sugaya T,Hikawa A,et al.Urinary fatty acid binging protein as a new clinical marker for the progression of chronic renal disease〔J〕.Rinsho Byori,2003;51(2):219-24.

4 Thomas ME,Harris KP,Walls J,et al.Fatty acid exacerbate tubulointerstitial injury in protein-over-load proteinuria〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol,2002;283(10):F640-7.