血管組織細胞抽提物體外調控間質干細胞向內皮細胞分化的研究

潘侃達

骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在適宜的誘導條件下能夠分化成為多種間質組織，包括骨、脂肪、軟骨、心肌和骨骼肌細胞, 甚至還有神經元、星形膠質細胞等[1-2]。越來越多的研究表明，干細胞所處的微環境對干細胞的分化與表型變化有著十分重要的影響，而這個微環境主要是由干細胞周圍的成體細胞所產生。大量胚胎學研究[3-4]結果表明造血系統祖細胞與血管內皮細胞來源于共同的干細胞——間充質干細胞，因此本論文擬通過研究血管組織抽提物對MSC分化的影響，證明血管內皮細胞是否含有對MSC分化命運決定的物質組份。

1 材料和方法

1.1 材料

SD大鼠(浙江醫學科學院動物中心)、胎牛血清(杭州四季青生物技術有限公司)、DMEM培養基(Gibco，含1.0g/L葡萄糖)、青霉素-鏈霉素雙抗(Hyclone)、淋巴細胞分離液(Gibco)、混合型膠原酶和胰蛋白酶(Gibco)、蛋白酶抑制劑(Amresco)、TrizolReagent(Invitrogen)、Taq DNA polymerase(Promega)，dNTPs(Promega)、M-MLV Reverse transcriptase(Invitrogen)、瓊脂粉、瓊脂糖、DNA marker(BBI)、DEPC(上海生物工程有限公司)。

1.2 大鼠MSCs的分離培養

戊巴比妥鈉(50mg/kg體重)腹腔注射麻醉SD大鼠，無菌操作剝離股骨、脛骨，剪去兩端干骺端以顯露骨髓腔。然后，以5mL含20%肝素的基礎培養液(10%胎牛血清和100U/mL青/鏈霉素的DMEM)反復沖洗骨髓腔，制成細胞混懸液。將細胞混懸液加入裝有等體積淋巴細胞分離液的離心管上層，600g離心20min，液體分成4層，收集中間交界面處乳白色的單個核細胞層，加入基礎培養液，并將其最終體積調為6mL，400g離心5min，棄去上清液，加入基礎培養液制備單個核細胞懸液并計數。將單個核細胞以1×105cells/ml細胞密度接種于培養瓶，置37℃、5%CO2培養箱中培養，24h后吸出未貼壁細胞懸液重新培養，培養基每3天換液1次，2周后待貼壁細胞達90%融合時以0.125%胰酶消化，按1：3傳代，定期取生長狀態細胞進行倒置相差顯微鏡觀察。

1.3 血管組織細胞抽提物制備

無菌環境下取新鮮血管組織，用PBS沖洗三次，徹底去除表面附著物。然后剪碎，并在混合型膠原酶(0.5%)，37℃溫浴下消化6h；離心去掉上清，用胰酶(0.25%)再消化過夜；離心收集細胞沉淀，使用含蛋白酶抑制劑(1:100)細胞裂解液含重懸細胞，超聲破碎裂解細胞，然后4℃，14,000g離心15min，重復兩次。最后，將收集到的血管組織上清液在無菌條件下通過0.22um濾器過濾, 4℃冰箱保存待用。

1.4 大鼠MSCs的誘導分化

將第四代MSCs加入不同的誘導分化培養液進行誘導分化，間隔2～3d換液1次，誘導培養7～14天。誘導分化培養液分別為：基礎培養液+基礎培養液(實驗組1，體積數與其他兩組相等)、基礎培養液+熱處理血管組織上清液(實驗組2，煮沸15min后置冰浴立即冷卻)、基礎培養液+血管組織上清液(實驗組3)。另外，以相同條件培養原代血管內皮細胞作為陽性對照，進行特異性基因表達分析。當細胞培養融合成單層, 待細胞長滿瓶底的80%時用0.125%的胰酶消化, 進行傳代培養。

1.5 細胞分化鑒定

RT-PCR(Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)作為一種有效地檢測基因表達的方法被廣泛應用。本論文采用該方法從mRNA水平檢測內皮細胞特異性基因是否表達，從而判斷MSCs是否向血管內皮細胞發生分化。本論文所采用的引物序列見表1。擴增條件按照正常PCR進行。

表1 內皮細胞特征性基因檢測特異性引物Table 1 The primers of the specific genes in the endothelial cells

2 研究結果

2.1 大鼠MSCs表面形態學及表面抗原檢測

倒置顯微鏡下觀察傳代培養的大鼠MSCs呈扁平狀或多角形，生長旺盛時呈旋渦樣。隨著細胞密度的增加，胞體變得細長，形態類似成纖維細胞(見圖1A)。傳代至第四代(Progenitor 4,P4)后，使用流式細胞儀分析細胞表面標志物表達，結果表明MSC表面抗原細胞CD73、CD90表達陽性,而CD34為陰性表達,說明P4代的細胞呈比較“純化”的MSC(見圖1B)。

2.2 誘導分化后細胞表面形態學觀察

誘導培養后，三個實驗組的細胞表面形態基本沒有發生顯著變化，均生長旺盛。但是，隨著傳代次數的增加，扁平細胞增加，細胞呈現衰老狀態。

圖1 大鼠MSCs表面形態學觀察以及細胞表面抗原檢測

2.3 誘導分化后內皮細胞特征性基因表達檢測

取誘導分化培養后2周細胞，分別提取RNA，并采用RTPCR檢測內皮細胞特征性基因表達情況，結果表明添加血管組織上清液的誘導實驗組與原代培養內皮細胞內，均能檢測到CD31、CD33、CD144以及一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)的表達，而未加血管組織上清液的誘導實驗組和添加熱處理血管組織上清液的誘導實驗組內均無相關基因表達或表達量很低(見圖2)。

3 討論

圖2 MSCs誘導分化后內皮細胞特征性基因表達檢測

組織工程是近年來發展的熱點，間充質干細胞是目前最常用的種子細胞。許多研究[5-7]表明骨髓來源的間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)能在局部微環境影響下重新編程，在體外定向分化為不同類型的細胞,如成骨細胞、成纖維細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌肉細胞和內皮細胞等。這些結果表明細胞外基質成份對干細胞的命運具有決定性作用。但是，本研究通過在含內皮細胞抽提物的誘導培養液中培養間充質干細胞，使其在培養兩周后表達內皮細胞特異性標志物，證明MSCs的分化方向不僅與細胞外基質環境密切相關，而且也受所處環境成體細胞內誘導因子的影響，分離鑒別這些誘導因子，對于間充質干細胞進一步在臨床上的運用具有重要的意義。

細胞表面分子是多種細胞分化和定型的標志。一般認為，MSCs不表達分化相關的標志，如Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原或堿性磷酸酶等，在細胞貼壁附著后，細胞均一致表達CD44、CD73、CD90、CD105、CD120a和CD124等多種表面蛋白[8-9]。但目前對MSCs表面特異性標志物的認識，尚存在不同觀點。本實驗選擇CD90、CD73作為MSCs的特征性表面分子進行細胞鑒定。

血管內皮細胞普遍公認的特異性標志物包括CD31、CD34、CD144以及一氧化氮合酶等[10-11]。本研究通過膠原酶與胰酶的處理，徹底去除細胞外基質成份。然后裂解內皮細胞使其內容物外露，從而可以直接與間充質干細胞結合，成功地誘導其分化為可表達血管內皮細胞特征性標志物的細胞，驗證了MSCs的多向分化潛能，也說明干細胞的分化機制和誘導條件很復雜，可受到很多因素的影響。此外，在圖2中，可以看出熱處理血管組織上清液誘導MSCs分化培養后，CD31和CD34也有痕量表達，這可能是由于血管組織抽提物內含有非蛋白質誘導因子或者是蛋白因子變性不徹底，從而使MSCs發生部分分化造成的。

總之，利用BMSCs可誘導出具有血管內皮細胞特性的細胞，該細胞可在體外繼續培養擴增，可作為構建組織工程化血管的種子細胞。

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