豬傳染性胸膜肺炎的診斷技術

謝芳，張艷禾，司微，劉思國，王春來

（中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所，獸醫生物技術國家重點實驗室動物細菌病研究室， 黑龍江哈爾濱 150001）

豬傳染性胸膜肺炎（PCP），是一種高度傳染性、致死性的呼吸系統傳染病。該病的主要特征是急性與亞急性病例呈現纖維素性出血性胸膜肺炎、慢性病例呈現纖維素性壞死性胸膜肺炎。1957年，英國人Pattison等首次發現該病，目前已在世界各國廣泛流行，造成巨大的經濟損失，嚴重阻礙了世界養豬業的健康發展，成為國際公認的危害現代化養豬業的重要傳染病之一。隨著現代養殖業規模化、集約化的發展，本病的發生呈暴發趨勢，并且近年來該病常與其它呼吸系統疾病繼發感染或混合感染，如該病與豬藍耳病、豬偽狂犬病、豬支原體肺炎、豬肺疫、副豬嗜血桿菌病等混合感染，加重了其危害性。目前，該病引起了國內外研究者的廣泛關注，是豬細菌性傳染病研究的熱點之一。1987年，哈爾濱獸醫研究所首次在我國報道該病，此后在許多省市陸續發現該病。2006年，對洛陽地區規?；i場進行血清學調查，陽性率為30.39%，2009年，對四川部分地區的1062份非免疫豬血清進行檢測，平均陽性率為18.5%。

一、病原學

該病的致病菌是胸膜肺炎放線桿菌（APP），最初被稱為副溶血嗜血桿菌或胸膜肺炎嗜血桿菌。1953年，Pohl等通過DNA雜交試驗表明，該菌與林氏放線桿菌關系密切，因此將其劃歸于巴氏桿菌科，放線桿菌屬，并命名為胸膜肺炎放線桿菌。

（一）生物學特性 APP為革蘭氏陰性球桿菌，具有多形態，常呈小桿菌或球桿菌。兼性厭氧，具有莢膜和纖毛，不形成芽孢。近年來研究發現該菌有鞭毛，具有運動性，長約3μm，寬約0.5μm 。

APP的培養特性：該菌生長的最適溫度為37℃，最佳pH值為7.6～7.8，供給5%～10%CO2會促進其生長發育。該菌營養要求較高，在普通瓊脂平板不生長，最適生長的培養基為巧克力瓊脂平板、綿羊血瓊脂平板及馬血清肉湯平板等。該菌對外界環境條件抵抗力不強，不能在外界環境中持續存在，60℃加熱15 min即死亡，對日光、干燥和一般化學消毒劑抵抗力低，1%漂白粉、1:100百毒殺都可在2 min使其滅活。但對結晶紫、桿菌肽、壯觀霉素和林肯霉素等有一定的抵抗力。

APP的形態特征：該菌在綿羊鮮血瓊脂平板上37℃培養24 h后，菌落呈圓型、針尖大小、邊緣整齊、中間稍凸，呈β溶血；以同樣條件在巧克力瓊脂平板上培養，菌落形態會稍大。在綿羊鮮血瓊脂平板上培養時，金黃色葡萄球菌的劃線兩側，能夠加重溶血區，稱為“cAMP”現象。將1%NAD液交叉劃線于馬血清肉湯瓊脂平板上，37℃培養18 h后，畫線近端處的菌落生長旺盛，遠端生長較少，稱為“衛星”現象，此為該菌生物Ⅰ型的典型特征。生物Ⅱ型不需要NAD就可生長，其它特征同生物Ⅰ型。

（二）血清分型 根據APP的生長是否需要煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD，又稱V因子），可將APP分為生物I型和生物Ⅱ型。生物I型生長需要NAD，生物Ⅱ型生長可不需要NAD，但需要其它特定的吡啶核苷酸或其前體以合成NAD。

根據APP表面莢膜（CPS）和脂多糖（LPS）抗原性的不同，可將APP分為15個血清型，血清1型又分為1a和1b兩個亞型，血清5型又分為5a和5b兩個亞型；血清型1～12、15屬于生物I型，血清型13、14屬于生物Ⅱ型。此外，還有一些分離到的APP依據現在的分類系統還不能劃分其血清型。

APP的15種血清型都能致病，但毒力存在明顯差異，其中血清型1、5、9和11被認為毒力最強，常見于急性暴發、高死亡率和肺臟出現嚴重病變；其它血清型的毒力較弱，被認為毒力最低的是血清3型和6型。

APP不同血清型的免疫原性也存在很大的差別，血清型間不存在交叉保護，針對某一血清型的滅活苗無法對APP其它血清型提供保護。然而有些血清型的菌株之間有相似的膜蛋白或脂多糖成分，引起了血清學交叉反應，給該病的分型診斷造成了一定的困難，如在血清型l與7之間，l、9及11之間，3、6及8之間，4與7之間。

二、流行病學

該病分布廣泛，流行于世界各國。各個國家和地區流行的血清型不同，如歐洲流行的血清型主要為1、2、5、7和9型；美國流行的血清型主要為l、5和7型；加拿大流行的血清型主要為1、3和5型；日本流行的血清型主要為5、6和7型；我國流行的血清型主要為1、3、5和7型。隨著各國之間引進種豬的不斷增多，血清型也更復雜。一些國家或地區可能同時流行多個血清型，甚至同一豬場內還可能存在不同血清型。存在于我國的APP血清型非常多，目前已發現并分離到血清型1、2、3、4、5、7、8和15等多種血清型。

該病于氣候驟變時多發，如冬末春初或夏末秋初；夏季也時有發生。飼養條件差可誘發該病，如飼養密度過高、圈舍潮濕、通風不良、塵埃多等不良因素。各種年齡的豬均對APP易感，3～4月齡豬多發，成年種公母豬也有散發。

該病主要由空氣傳播、接觸病豬及其污染物傳播，引進帶菌豬或慢性感染豬是其最主要的傳播途徑，從而造成未感染該病的豬群發病。1988年，朱士盛等對10個省份的296頭進口豬進行血清學調查，發現陽性率為26.7%，表明該病在我國的發生與引種有密切關系。

近年來，該病常與豬藍耳病、豬支原體肺炎、豬偽狂犬病、豬肺疫、豬瘟、副豬嗜血桿菌病等混合感染，導致病情加重，死亡率升高。一般來說，該病受氣候環境、飼養條件的影響，發病率和死亡率差異很大，分別在8.5%～100%和0.4%～100%。

三、臨床癥狀和病理變化

APP隨氣流進入呼吸道，在肺泡內定居、增殖并產生毒素，導致纖維素性出血性胸膜肺炎?；疾∝i的主要病變在胸腔內，典型特征是呈現纖維素性、出血性和壞死性肺炎。

最急性病例臨床表現為突然發病，體溫高達41℃，沉郁，食欲不振，并出現嘔吐和腹瀉，臥地不起，呼吸困難，張口呼吸，口鼻腔流出泡沫樣液體，呈紅色，多于24～36 h內死亡。病理變化：肺部呈紅色腫脹，表面出現出血點，呈粟粒大小；肺切面多汁，流出紅色液體，氣管腔內充滿泡沫樣紅色液體。有些病例肺小葉間質明顯增寬。

急性病例臨床表現為體溫高達41℃～42℃，呈稽留熱，精神高度萎靡，食欲漸少乃至廢絕。呈現出不同程度的呼吸困難，表現為呼吸加快、張口呼吸呈犬坐式，且伴有咳嗽和呻吟。黏膜呈現潮紅或紫紅色，鼻腔流出漿液或粘液性棕紅色鼻液。耳鼻、四肢、腹下等處淤血。多數病豬于2～3 d內窒息死亡。少數病豬出現腹瀉和嘔吐癥狀。部分病豬如果及時治療可以轉歸痊愈。病理變化：胸腔內出現大量積液，呈黃色或紅黃色。肺葉腫大，肺膜增厚、粗糙，多數病例肺葉出現大小不一的斑塊，呈紫紅色，嚴重病例肺臟呈紫紅色病變，質地堅實，有些病例肺葉部分區域出現大理石狀條紋，呈紫紅色、灰紅色和灰白色相間，質硬如肝。

亞急性和慢性病例多是由于急性病例治療不當轉化而來所造成的，臨床表現為食欲減退、消瘦、間歇性咳嗽，易繼發感染其它病原而使癥狀加重甚至導致死亡。某些病例母豬流產、關節炎，并且豬體不同部位出現膿腫。病理變化：肺臟呈現大小不等、由結締組織包裹的壞死性結節。結節處胸壁和肺臟粘連，切開會流出灰白色膿樣物。嚴重病例心包、心外膜、胸膜、肺以及膈肌等多處廣泛粘連。有時還伴有全身廣泛性淤血和出血、出血性淋巴結炎和急性脾炎等變化。

四、診斷

對APP的診斷與檢測主要是通過病原學、血清學或分子生物學的方法。

（一）病原學診斷方法 傳統的病原學診斷方法主要是對APP分離與鑒定。一般是從病豬的鼻腔、支氣管、肺臟病變組織處或胸水等處進行分離。所用培養基需要營養豐富，一般該菌可在巧克力瓊脂平板或綿羊血瓊脂平板上分離出。經形態染色、生化試驗、呈現“cAMP”及“衛星”現象、溶解綿羊血、尿素酶試驗陽性，可鑒定為APP生物Ⅰ型菌株，如果生長時還不需要NAD，可鑒定為生物Ⅱ型菌株。可同時結合協同凝集試驗或瓊脂擴散試驗等血清學診斷方法做確診，或是結合PCR等分子生物學診斷方法做確診。

此外，免疫磁珠法是一種新出現的APP分離方法。1998年，Gagne等用免疫磁珠法從感染血清1型的豬體中分離到APP，該方法是先用特異性多克隆抗體或單克隆抗體包被磁珠，再將磁珠與病料相互作用，在磁場作用下分離出該菌。2001年，Angen等也用免疫磁珠法從血清2型感染豬體中分離到APP。相對于傳統的細菌分離方法，免疫磁珠法更準確和簡便，并且比PCR方法更靈敏，但對儀器設備要求較高，因此不適于基層廣泛應用。

（二）血清學診斷方法 APP的血清學診斷方法主要有補體結合試驗、間接血凝試驗、協同凝集試驗、乳膠凝集試驗、瓊脂擴散試驗和酶聯免疫吸附試驗等。

1.補體結合試驗（CFT）是由Nicolet于1971年首次將其用于檢測APP并迅速成為APP分型的最早標準方法。CFT的敏感性和特異性較好，檢出率可達100%，感染APP兩周后就可檢出抗體，因此多年來被用于APP的檢測，并且該方法能夠區分與APP親緣關系較近的細菌，如副豬嗜血桿菌等。但CFT操作繁瑣、費時費力，所以一般只在實驗室中使用。

2.間接血凝試驗（IHA）是由Mittal于1983年建立并將其用于APP檢測和分型。1990年，Mittal等發現凝集試驗和COA不能區分血清1型和9型，而IHA卻能區分二者。

3.協同凝集試驗（COA）是一種簡單快速的APP檢測和分型的方法。1988年，Mittal等 將2-疏 基乙醇試管凝集、COA和瓊脂糖擴散試驗結合并用于APP檢測，可以區分血清6型與其它血清型。1991年，Mittal等發現需要結合應用COA和瓊脂擴散試驗以區分血清4型和7型。相比于IHA和瓊脂擴散試驗，COA簡單、快速，特異性較高，適于臨床推廣應用。

4.乳膠凝集試驗（LAT）是一種快速簡捷的APP檢測和定型方法。1992年，Inzana等首次將LAT引入到APP的檢測中，并發現LAT能區分血清l型和9型。1995年，Inzana提出一種改進的乳膠凝集試驗方法，該方法靈敏度高、特異性好，不與多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌和豬放線桿菌交叉反應，并且該方法不需要大量儀器設備，非常適于快速臨床檢測，具有良好的應用前景。

5.瓊脂擴散試驗又稱免疫擴散試驗，能輔助其它試驗區分交叉反應的APP血清型，如協同凝集試驗或2-疏基乙醇試管凝集等。但瓊脂擴散試驗的敏感性和特異性都不如ELISA。

6.酶聯免疫吸附試驗（ELISA）是近年來檢測APP的最常用的血清學診斷方法。1981年，Nicolet等首次用ELISA試驗對APP進行分型。1992年，Trottier等制定了一個鑒別APP血清5型的ELISA試驗的標準草案。目前，ELISA已經成為檢測APP的主要方法之一。

（三）分子生物學診斷方法 PCR技術是用于檢測APP的主要分子生物學診斷方法。由于PCR技術的快速、簡便、靈敏性高、特異性好和無交叉反應等優點，使得近年來PCR方法成為國內外檢測APP的最主要的方法。目前，國內外己經建立了多種PCR檢測方法用于豬傳染性胸膜肺炎的早期診斷和APP的快速鑒定。1995年，Frey等建立了基于Apx的PCR檢測方法，并能將所有APP血清型區分為4種Apx類型，不僅提高了APP檢測率和流行病學調查的效率，還有助于發現非典型的溶血素分子結構。1995年，Gram和Ahrens建立了基于omlA基因的PCR檢測方法，具有較高的種特異性和敏感性。2001年，Schaller等建立了基于apxⅣA基因的PCR檢測方法，特異性和敏感性均很高。2009年，Yang等針對apx Ⅳ 基因建立了檢測APP的環介導等溫擴增技術，比巢氏PCR敏感十倍，認為是高敏感性和特異性的檢測方法。

此外，PCR方法還可以通過血清型特異的引物起到區分血清型的作用。一直以來，國內外很多學者都在研究和改進APP的PCR分型系統。2000年，de la Puente-Redondo等建立了基于tbpA和tbpB基因的PCR-RFLF診斷與分型方法，具有較高的種特異性和敏感性，能同時將所有APP血清型分為10個RFLP類型，但無法區分血清型4和11、血清型7和9。2000年，Gram等建立了基于溶血素和omlA基因的PCR診斷與分型方法，能區分大多數APP血清型，但不能區分血清型1和9、血清型2、8和11。此后，研究者還建立了多種多重PCR方法能同時分型檢測幾種不同的血清型，并能區分具有血清交叉反應的血清型，如血清型2、5和6，血清型1、2和8，血清型1、7和12，血清型3、6和8，血清型1、2和5。

此外，還有許多正在處于研究階段的新方法，如抗APP單克隆抗體的制備、APP膠體金診斷試紙條的研制、基因芯片檢測方法，這些方法既方便又快捷，可用于大規模的APP檢測，既能確定種又能分型鑒定，有良好的應用前景。

（略）