高效液相色譜法測定金雞片中穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯含量

張火旺，謝雄瑞，黃湖斌

（1.廣東省河源市藥品檢驗所，廣東 河源 517000； 2.廣東藥學院中藥學院，廣東 廣州 510006）

金雞片由金櫻根、雞血藤、千斤拔、穿心蓮、功勞木、兩面針等6味中藥組成，具有清熱解毒、健脾除濕、通絡活血的功效，用于治療濕熱下注引起的附件炎。其現行藥品標準[1]中只有定性項無含量測定項。為確保制劑質量，保證用藥安全有效，筆者采用高效液相色譜（HPLC）法測定了該制劑中穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯的含量，報道如下。

1 儀器與試藥

安捷倫1200型自動高效液相色譜儀；日本島津UV-2450型紫外分光光度計；CP225D型電子天平；SB2200型超聲處理器。甲醇（色譜純，TEDIA），水為超純水；穿心蓮內酯及脫水穿心蓮內酯對照品（批號分別為0797-200105，0854-200103，供含量測定用，均購自中國藥品生物制品檢定所，含量均為100%）；金雞片（市售品，批號分別為 20080504，20080601，20080701，IA007，依次分別編號為1，2，3，4）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件[2]

色譜柱：Hypersil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（50∶50）；穿心蓮內酯檢測波長：225 nm，脫水穿心蓮內酯檢測波長：250 nm；流速：0.8 mL/min；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

精密稱取經五氧化二磷干燥24 h的穿心蓮內酯對照品10.34 mg，置100 mL量瓶中，用甲醇溶解至刻度，作為穿心蓮內酯對照品貯備液；精密稱取經五氧化二磷干燥24 h的脫水穿心蓮內酯對照品10.13 mg，置50 mL量瓶中，用甲醇溶解至刻度，作為脫水穿心蓮內酯對照品貯備液；各用0.45 μm濾膜濾過，即得對照品溶液。取樣品20片，除去包衣，精密稱定，研細（過3號篩），精密稱取適量（約相當于2片的質量），置50 mL量瓶中，加甲醇適量，密塞，超聲30 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續濾液，即得供試品溶液。按處方工藝制備不含穿心蓮的陰性樣品，同法制備成陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

干擾試驗：分別取2.2項下3種溶液，按上述色譜條件進樣測定。可見2組分的出峰時間處無干擾峰，表明處方中其他成分及輔料對樣品測定無干擾（見圖1）。

圖1 高效液相色譜圖

線性關系考察：分別精密量取穿心蓮內酯對照品貯備液和脫水穿心蓮內酯對照品貯備液 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，置50 mL和25 mL量瓶中，加甲醇至刻度并搖勻，分別配成穿心蓮內酯對照品和脫水穿心蓮內酯對照品溶液，按上述色譜條件分別進樣測定峰面積，以峰面積積分值（A）為縱坐標、穿心蓮對照品質量濃度（C）為橫坐標繪制標準曲線，回歸方程為穿心蓮內酯 A=25.555 C+0.641 3，r=1.000 0；脫水穿心蓮內酯 A=20.234 C-12.099，r=0.999 8。結果表明穿心蓮內酯與脫水穿心蓮內酯進樣量分別在 0.020 68～0.124 08 μg和 0.081 04～0.486 24 μg范圍內與峰面積積分值線性關系良好。

精密度試驗：取同一對照品溶液，連續重復進樣測定。結果峰面積的 RSD分別為1.7%和0.43%（n=6），表明儀器精密度良好。

重現性試驗：取同一批樣品6份，依法平行測定2組分含量。結果穿心蓮內酯與脫水穿心蓮內酯的 RSD分別為0.63%和0.60%（n=6），表明方法重現性良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，室溫放置，每隔2 h測定1次。結果穿心蓮內酯與脫水穿心蓮內酯含量的 RSD分別為0.71%和0.48%（n=7），表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

加樣回收試驗：精密稱取已知含量的樣品（批號為20080504，穿心蓮內酯含量為0.635 1 mg/g，平均片重0.325 0 g/片）適量，共6份，分別加入穿心蓮內酯對照品溶液（0.051 35 mg/mL）2，4，5 mL按供試品溶液制備方法操作，進樣測定含量。精密稱取已知含量的樣品（批號為20080504，脫水穿心蓮內酯含量為1.166 0 mg/g，平均片重0.325 0 g/片）適量，共6份，分別加入脫水穿心蓮內酯對照品溶液（0.202 6 mg/mL）1，2，3 mL，按供試品溶液制備方法操作，進樣測定含量。結果見表1。

表1 穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯加樣回收試驗結果（n=6）

2.4 樣品含量測定

取4批樣品，依法測定峰面積，按外標法計算含量。結果見表2。根據4批樣品所測結果，暫訂金雞片中穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯總量限為1.0 mg/g。

表2 4批樣品含量測定結果（mg/g，n=3）

3 討論

取穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯對照品適量，以甲醇為溶劑，經紫外-可見分光光度計掃描，穿心蓮內酯在225 nm波長處有最大吸收，而脫水穿心蓮內酯在250 nm波長處有最大吸收，靈敏度高，故選225 nm作為穿心蓮內酯檢測波長，250 nm作為脫水穿心蓮內酯檢測波長。分別超聲處理樣品 10，20，30，40，60 min，結果 2 組分含量最高的為超聲30 min，故認為超聲30 min基本提取完全。曾以甲醇-水溶液（55∶45）為流動相，但樣品的分離度不好，主峰形不好；用甲醇-水溶液（40∶60）為流動相時，主峰分離好，但保留時間太長，不適合研究；而用甲醇-水溶液（50∶50）為流動相時主峰峰形較對稱，分離效果較好。

4批樣品中，不同廠家、批次的含量相差較大。方法學考察結果表明，本法回收率、精密度、重現性好，可更好、更進一步完善金雞片的質量標準。

[1]WS3-B-3432-98，中華人民共和國衛生部藥品標準·中藥成方制劑（第18冊）[S].

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：化學工業出版社，2005：附錄33.