硫磷鐵法測(cè)定大豆甾醇提取物中總甾醇含量

徐小軍，余國珍，陳鑒東

（浙江京新藥業(yè)股份有限公司，浙江 新昌 312500）

大豆甾醇提取物為豆科植物大豆 Glycine max（L.）Merr.果實(shí)在生產(chǎn)大豆油過程中的副產(chǎn)物——脫臭餾出物經(jīng)提取純化所得的甾醇類化合物，主要含有β-谷甾醇、豆甾醇及菜油甾醇等多種活性植物甾醇，具有調(diào)血脂、抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等多種生理功能[1]。文獻(xiàn)報(bào)道的總甾醇含量測(cè)定方法有重量法[2]、分光光度法等，前者已較少被采用，分光光度法中有采用醋酐-濃硫酸顯色法（Lieberman-Burchard反應(yīng)原理）[3]及香草醛-冰醋酸、高氯酸比色法[4]，但此兩方法因干擾成分及影響因素較多，試劑的用量、反應(yīng)時(shí)溫度以及反應(yīng)后放置時(shí)間等因素影響較明顯，測(cè)定結(jié)果往往比實(shí)際偏高且重現(xiàn)性較差。筆者參考有關(guān)文獻(xiàn)，將測(cè)定血清膽甾醇常用方法硫磷鐵顯色法[5-6]用于大豆總甾醇含量測(cè)定。硫磷鐵法的原理是甾醇在濃硫酸及三價(jià)鐵的作用下形成比較穩(wěn)定的紫紅色化合物，其在520～550 nm波長(zhǎng)處有特征吸收峰，且質(zhì)量濃度與吸光度呈正比關(guān)系。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

TU-1800型、TU-1900型分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。大豆甾醇（批號(hào)為 20081101，20081102，20081103，浙江京新藥業(yè)股份有限公司）；β-谷甾醇對(duì)照品（批號(hào)為110851-200605，含量為98.0%，中國藥品生物制品檢定所）；濃磷酸、濃硫酸及三氯化鐵均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

取60℃減壓干燥至恒重的β-谷甾醇對(duì)照品約2.5 mg，精密稱定，加無水乙醇溶解并定容至25 mL，即得對(duì)照品溶液。取樣品約70 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，精密移取5.0 mL稀釋并定容至50.0 mL，搖勻，即得供試品溶液。稱取三氯化鐵（FeCl3·6H2O）2.5 g，溶于87%濃磷酸內(nèi)，并定容至100 mL，得鐵貯存液，此液可長(zhǎng)期保存。取鐵貯存液8.0 mL，加濃硫酸至100 mL，即得磷硫鐵顯色劑。精密移取5.0 mL對(duì)照品或供試品溶液，置10 mL具塞刻度試管中，再沿管壁緩慢地向各試管中加入5.0 mL磷硫鐵顯色劑，搖勻，室溫下冷卻30 min，即得對(duì)照品或供試品的顯色溶液，以無水乙醇同法作空白。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

精密移取5.0 mL對(duì)照品溶液及供試品溶液，以無水乙醇為空白參比，分別按2.1項(xiàng)下方法制得顯色溶液，于750～350 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。結(jié)果對(duì)照品溶液與供試品溶液在530 nm波長(zhǎng)處具有相同的最大吸收峰，故選擇530 nm為測(cè)定波長(zhǎng)（圖 1）。

圖1 紫外光譜圖

2.3 顯色劑用量確定

精密移取5.0mL供試品溶液，分別用1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL磷硫鐵顯色劑，用濃硫酸補(bǔ)足至10.0 mL，搖勻，室溫下冷卻30 min，于530 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。結(jié)果對(duì)應(yīng)的吸光度分別為0.175，0.397，0.594，0.650，0.653。可見，顯色劑用量達(dá)到 4.0 mL 后吸光度達(dá)最大并趨于穩(wěn)定，為移液及計(jì)算方便，確定顯色劑用量為5.0 mL，定容為10.0 mL的體系。

2.4 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密移取 0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL β - 谷甾醇對(duì)照品溶液，置10 mL具塞刻度試管中，各加入無水乙醇5.0，4.0，3.0，2.0，1.0，0 mL，分別按 2.1 項(xiàng)下方法制得對(duì)照品顯色溶液，照分光光度法[2005年版《中國藥典（一部）》附錄ⅤB]在530 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度（Y）對(duì)β-谷甾醇質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為 Y=13.586 X+0.021 4，r=0.999 6（n=6）。結(jié)果表明β-谷甾醇質(zhì)量濃度在10.29～51.45 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密移取對(duì)照品溶液5.0 mL，按2.1項(xiàng)下方法制得對(duì)照品顯色溶液，測(cè)定吸光度。結(jié)果 RSD為1.3%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密移取供試品溶液5.0 mL，加入5.0 mL磷硫鐵顯色劑顯色后，分別于 0，30，60，90，120，150，180 min 時(shí)測(cè)定吸光度。結(jié)果 RSD為0.6%（n=7），表明供試品溶液在3 h內(nèi)穩(wěn)定。

重現(xiàn)性試驗(yàn)：精密稱取同一批樣品（批號(hào)為20081101），依法測(cè)定。結(jié)果總甾醇的平均含量為97.17%，RSD=1.6%（n=6），表明方法重現(xiàn)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知總甾醇含量的樣品（批號(hào)為20081101）約3.5 mg，精密稱定，分別精密移入已知含量的對(duì)照品溶液（356.20 μg/mL）5，5，10，10，15，15 mL，溶解至 100 mL，依法測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 總甾醇加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.5 樣品含量測(cè)定

取3批樣品，按2.1項(xiàng)下方法制得供試品顯色溶液，于530 nm波長(zhǎng)處依法測(cè)定，計(jì)算總甾醇含量。結(jié)果批號(hào)分別為20081101，20081102，20081103的含量分別為98.2%，98.6%，97.5%。

3 討論

磷硫鐵顯色劑最好是新鮮配置的，否則會(huì)影響顯色程度，但鐵貯存液可長(zhǎng)期保存。穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，顯色反應(yīng)快且3 h內(nèi)顯色穩(wěn)定，但對(duì)照品溶液或供試品溶液與磷硫鐵顯色劑混合時(shí)會(huì)放出大量熱，使溶液溫度明顯升高，故應(yīng)冷卻30 min至室溫后，再測(cè)定吸收度。

方法學(xué)考察結(jié)果表明，本測(cè)定方法重現(xiàn)性良好，操作簡(jiǎn)便，對(duì)照品用量少（β-谷甾醇對(duì)照品價(jià)格昂貴），檢測(cè)成本低，為大豆總甾醇的含量測(cè)定建立了一種快速而經(jīng)濟(jì)有效的方法。

[1]韓軍花.植物甾醇的性質(zhì)、功能及應(yīng)用[J].國外醫(yī)學(xué)·衛(wèi)生學(xué)分冊(cè)，2001，28（5）：285-291.

[2]胡于魯，劉銀燕.重量法測(cè)定大豆甾醇的含量[J].白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，21（1）：99-100.

[3]李英霞，王風(fēng)云.可見分光光度法測(cè)定大豆甾醇提取物中總甾醇的含量[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，9（5）：154-155.

[4]魏璐雪.中藥制劑分析[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1997：185-186.

[5]王繼貴，粟春輝，袁大偉，等.臨床生化檢驗(yàn)[M].長(zhǎng)沙:湖南科學(xué)技術(shù)出版社，1981：205-206，370.

[6]楊昌國.血清高密度脂蛋白膽固醇微量測(cè)定法[J].中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，1979，2（2）：85.