黃芪多糖對犬脾淋巴細胞細胞因子mRNA表達的影響

邱河輝,趙 娟,劉鳳華,朱曉宇,甘靜宜,王霞泰,許劍琴

(1.中國農業大學動物醫學院,北京海淀100193;2.北京農學院動物科技系,北京昌平102206;3.農業部獸用化藥和中草藥創制與評價重點開放實驗室,北京海淀100193)

隨著養犬數量的快速增加,病毒性疾病嚴重威脅犬的健康。犬瘟熱病毒、犬細小病病毒等誘導非炎性淋巴細胞程序性衰竭,侵入并破壞機體免疫系統[1]。脾臟是機體外周免疫應答的重要場所,抗原一旦進入即可誘導 T細胞和 B細胞的活化與增殖[2]。因此,開發能增強犬抵抗病毒性疾病、增強脾臟免疫細胞功能的中獸藥很有研究意義。研究表明,黃芪多糖(APS)對機體非特異性免疫與特異性免疫有廣泛的影響,可促進T淋巴細胞轉化和增強B淋巴細胞活性[3],促進 IL-2、TNF-α、IFN-γ等細胞因子的分泌[4]。目前,APS對犬脾淋巴細胞細胞因子mRNA表達的研究鮮見報道,對犬免疫平衡的調節還有待深入研究。本研究用APS與ConA或LPS協同刺激犬脾淋巴細胞,觀測相關細胞因子mRNA的表達,探討APS對犬細胞免疫功能的影響,為其臨床應用和保健品的開發提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 APS(批號:HD006001,北京美迪克斯生物科技有限公司),RPMI-1640培養基(批號:NSG0059,海克隆生物化學制品有限公司),Hank's Balanced Salt(批號:ASD29233,海克隆生物化學制品有限公司),淋巴細胞分離液(批號:080712,灝洋生物公司),Trizol Reagent(批號:1401902,Invitrogen),LPS(批號:L2880,Sigma),ConA(批號:C2631,Sigma),HEPES(批號:0511,Amresco)。

1.2 犬脾淋巴細胞的采集 5月齡中華田園犬麻醉后放血致死,常規方法制備脾淋巴細胞[5]。細胞懸浮于RPMI-1640完全培養液(含10%胎牛血清,100 IU/mL 青霉素 、100 μ g/mL 鏈霉素 ,12 mmol/L HEPES(pH 7.1),0.05 mmol/L 2-巰基乙醇)。細胞懸液用0.3%臺盼藍染色,顯微鏡下計數活細胞數大于95%,最后調整細胞濃度為2×106cells/mL。1.3 犬脾淋巴細胞培養 按參考文獻報道方法[6],對照組(CG)只加 1 mL完全培養基;ConA組加0.05 μ g/μ L ConA 300 μ L;LPS 組加 0.1 μ g/μ L LPS 300 μ L;APS 組 加 0.1 μ g/μ L APS 300 μ L;APS+ConA 組加 0.1 μ g/μ L APS 300 μ L 和 0.05 μ g/μ L ConA 300μ L;APS+LPS 組加 0.1 μ g/μ L APS 300 μ L 和 0.1 μ g/μ L LPS 300 μ L,各組加入2 mL細胞懸液,最后完全培養基補充至3 mL。每組6個重復,37℃、5%CO2培養箱中孵育48 h。

1.4 犬脾淋巴細胞細胞因子mRNA表達

1.4.1 總RNA提取 細胞懸液吸至離心管中,1 500 r/min(4℃)離心 10 min,冷 PBS洗滌 1次。沉淀中加T rizol Reagent 1.0 mL,常規方法提取細胞總RNA,20 μ L DEPC水溶解。

1.4.2 引物設計 參照GenBank網站公布的犬相關基因序列的CDs保守區,用Primer Premier 5.0和Oligo 6軟件設計相關基因引物,其引物序列和擴增產物為β-actin上游GGAACGCAAGTAT TC TGTG,下游 TCCCAACCCTGT TAGACC;IL-2 上游 ATCGCACTGACGCT TGTA,下游 AAACCT AGCACT TCCTCC;IL-12上游TTAGCAGCATC TATGAGGA,下游CAAGGGAGGATT TCTGTG;IFN-γ上游 GATGTATCGGACGGTGGG,下游GT TCATT TATCGCCT TGC;TNF-α上游CAGCCTCTTCTCCTTCCTC,下游 ACCCATCTGACGGCAC TA;IL-4上游 GCACTCACCAGCACCTTT,下游GCCGCAGTACAGTAGCAG

1.4.3 cDNA的合成及PCR擴增 cDNA合成及PCR反應:反轉錄cDNA后進行PCR擴增,擴增反應程序為:94℃5 min,94℃40 s,56.6℃(β-actin)、57.2℃(IL-2)、57.4℃(IL-12)、56.4℃(IFN-γ)、56.6℃(TNF-α)、57.6℃(IL-4)、40 s,72 ℃50 s,30個循環后,72℃自動延伸10 min,4℃結束反應。

1.4.4 RT-PCR產物灰度分析及數據處理 凝膠成像和分析系統以目的基因IL-2、IL-4、IL-12、IFN-γ、TNF-α增量與內對照β-actin擴增量比值分別表示它們的mRNA相對表達量。

2 結果

2.1 APS協同ConA或 LPS刺激犬脾淋巴細胞Th1細胞因子mRNA表達 圖1顯示,與CG相比,APS可顯著(P＜0.05)提高 IL-2、IFN-γ和TFN-αmRNA的表達;ConA促進IFN-γ和TNF-α mRNA的表達(P＜0.05);APS+ConA顯著(P＜0.05)促進IFN-γ、TNF-α和降低 IL-2 mRNA 的表達;LPS顯著(P＜0.05)降低Th1型細胞因子mRNA的表達;APS+LPS顯著(P＜0.05)降低IL-2、IL-12和TNF-αmRNA的表達。與ConA組比較,APS顯著(P＜0.05)提高IL-2和IFN-γmRNA的表達;APS+ConA顯著(P＜0.05)促進IL-12、IFN-γ和TNF-αmRNA的表達。與LPS組比較,APS顯著(P ＜0.05)促進 IL-2、IL-12、IFN-γ和TFN-αmRNA的表達;APS+LPS顯著(P＜0.05)提高IFN-γ和 TNF-αmRNA的表達。

2.2 APS協同ConA或LPS刺激犬脾淋巴細胞IL-4 mRNA表達 圖 2表明,與 CG比較,IL-4 mRNA的表達ConA組和APS+ConA組顯著增加(P＜0.05),而LPS組和APS+LPS組顯著降低(P＜0.05)。與ConA組比較,APS+ConA組未見明顯變化。與 LPS組比較,APS組和APS+LPS組均顯著增加(P＜0.05),前者更加顯著。

3 分析與討論

CD4+T細胞可分為 Th1和 Th2兩個細胞亞群。Th1 細胞主要分泌 IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-12等細胞因子,主要介導細胞免疫應答;Th2細胞主要分泌 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和 IL-13等細胞因子,主要介導體液免疫應答[7]。

本研究中以IL-2 、IL-12、IFN-γ和 TNF-α mRNA的表達代表Th1型細胞因子的表達。圖1結果表明,APS對犬脾淋巴細胞 IL-2、IFN-γ和 TNF-α mRNA表達有顯著增強作用,促進 IL-2和IFN-γ mRNA表達的效果顯著優于ConA,對IFN-γ和TNF-αmRNA的表達與ConA表現出明顯的協同作用。這與前人報道的 APS能促進脾淋巴細胞Th1型細胞因子mRNA表達的結果一致[4]。LPS對4種細胞因子mRNA表達具有顯著抑制作用,APS能使它們的表達提高,表明APS具有介導細胞免疫應答的良好效果。

圖1 淋巴細胞Th1細胞因子mRNA的表達

值得注意的是,APS協同ConA促進Th1類IFN-γ和TNF-αmRNA的表達的同時,IL-2 mRNA的表達相對較低。陳國友等人[8]報道,淋巴細胞功能相關分子(LFA-1)能抑制誘導的脾淋巴細胞增殖,并抑制IL-2的分泌,而LFA-1僅作用于絲裂原活化脾淋巴細胞的早期。由此可見,試驗中IL-2 mRNA表達量的下降可能是APS協同ConA主要作用犬脾淋巴細胞活化的早期有關。

由圖2分析可見,APS對犬脾淋巴細胞IL-4 mRNA表達沒有明顯影響;ConA及其與APS協同均可顯著增加其表達,但是兩者之間未見顯著差異,表明APS與ConA的協同作用不明顯。LPS對IL-4 mRNA表達呈現顯著抑制作用;APS及其與LPS協同能使其表達顯著高于LPS。說明IL-4 mRNA表達抑制時,APS能使其表達得到顯著提高,發揮其免疫調節作用。

圖2 淋巴細胞IL-4 mRNA的表達

正常狀態下 Th1/Th2兩類細胞因子處于平衡狀態,以維持正常的免疫功能。有研究表明,當 T細胞在體外被激活時,Th1參與的反應常發生在早期,Th2細胞則隨著免疫應答的進展而增多[9],當Th1類細胞占優勢時,促進細胞免疫。本試驗結果說明,APS能促進犬脾淋巴細胞Th1型細胞因子的表達,APS與ConA有很好的協同性,APS能調節LPS對犬脾淋巴細胞的抑制作用。

4 結語

APS對犬脾淋巴細胞 IL-2、IFN-γ和 TNF-α mRNA表達有顯著增強作用,對IL-4 mRNA表達沒有明顯影響,當上述相關細胞因子mRNA表達抑制時,APS能使其表達得到顯著提高。

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