一氧化氮在三氧化二砷抑制馬立克病病雞腎臟腫瘤生長(zhǎng)中的作用

李金龍,國(guó) 琳,劉曉瑛,張久麗,3,孫 剛,徐世文

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,黑龍江哈爾濱150030;2.浙江省余姚市畜牧獸醫(yī)局,浙江余姚315400;3.黑龍江畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院,黑龍江雙城150100;4.黑龍江省動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所,黑龍江哈爾濱150008)

三氧化二砷(As2O3)是中藥砒霜的主要成分,我國(guó)學(xué)者應(yīng)用As2O3治療急性早幼粒細(xì)胞白血病取得良好的療效,從而為腫瘤的治療提供了一個(gè)新思路。雞馬立克病(MD)是由皰疹病毒屬馬立克病病毒引起的一種雞的惡性淋巴腫瘤性疾病,由于MD病雞的許多特性與哺乳動(dòng)物腫瘤的發(fā)生有相似之處,而被作為研究腫瘤性疾病的良好模型[1]。一氧化氮(NO)作為重要的生物介質(zhì)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和死亡中的作用,已成為腫瘤研究及治療的熱點(diǎn)。目前已有一些關(guān)于As2O3誘導(dǎo)體外培養(yǎng)MD腫瘤細(xì)胞株凋亡的研究[2-3],但關(guān)于NO代謝在其抑制雞腎臟腫瘤生長(zhǎng)的研究未見(jiàn)報(bào)道。本文旨在探討NO代謝在As2O3抑制雞馬立克病病雞腎臟腫瘤生成的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 As2O3注射液(1mg/mL)由本研究室制備。rTaq DNA聚合酶購(gòu)自大連TaKaRa公司,NO與一氧化氮合酶(NOS)分型試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;T rizol與M-MLV等試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與處理 試驗(yàn)動(dòng)物處理參見(jiàn)文獻(xiàn)

[4],分別于第35、40、45天斷頭處死,觀察病理解剖學(xué)變化,快速取試驗(yàn)組腫瘤組織和對(duì)照組腎臟組織,按常規(guī)法固定、制片、H.E.染色 。

1.3 雞腎臟及腫瘤組織中NO含量及NOS活性的檢測(cè) NO含量的測(cè)定采用硝酸還原酶法,總NOS(T-NOS)、誘導(dǎo)型 NOS(iNOS)與構(gòu)建型 NOS(cNOS)活性的測(cè)定采用化學(xué)比色法,具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 雞腎臟及腫瘤組織中iNOS mRNA表達(dá)水平的檢測(cè) 根據(jù)GenBank上iNOS基因序列(序列號(hào)U34045)與β-actin基因序列(序列號(hào) NM205518),應(yīng)用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)引物,由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。iNOS引物(PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度500bp)上游:5′-TTGTGCAT TGAGCTTGGGT-3′,下游 :5′-CCTCGCACACGGTACTCATT-3′;β-actin 引物(PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度282bp)上游:5′-ACGTCGCACTGGATT TCGAG-3′,下 游 :5′-TGTCAGCAATGCCAGGGTAC-3′

應(yīng)用Trizol試劑盒提取腎臟及腫瘤組織總RNA,并測(cè)定 RNA濃度及純度。取總 RNA 5.0 μ g,以加寡脫氧胸苷(Oligo(dT))為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μ L,進(jìn)行 50 μ L 反應(yīng)體系PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為:預(yù)變性95℃5 min,變性95℃1 min,退火 54.5℃(iNOS)、54℃(β-actin)、45 s,延伸 72℃1 min,30個(gè)循環(huán),72℃終延伸 7 min。分別以iNOS基因與β-actin基因的PCR產(chǎn)物的灰度比值來(lái)表示基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。1.5 試驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析與統(tǒng)計(jì) 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SAS軟件與Microsoft Excel 2000對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并作圖。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀觀察及病理學(xué)變化 對(duì)照組雞無(wú)異常。攻毒組雞表現(xiàn)出MD典型癥狀,如“劈叉”現(xiàn)象,剖檢可見(jiàn)腎臟表面有灰白色粟粒至綠豆大不等的病灶。攻毒組加砷組雞注射As2O3后,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)癥狀逐漸減輕,剖檢可見(jiàn)腎臟腫瘤出現(xiàn)明顯減少,生成的腫瘤也有明顯減小。病理組織學(xué)檢查可見(jiàn)對(duì)照組腎臟結(jié)構(gòu)正常。攻毒組病雞腎臟腫瘤組織由淋巴瘤細(xì)胞組成,瘤細(xì)胞大小不一致,有的可見(jiàn)核分裂相,核染色質(zhì)邊集,核呈空泡,雙核仁,細(xì)胞漿不清。攻毒組加砷組病雞腎臟組織瘤細(xì)胞浸潤(rùn)到腎小球之間,腎小球入球動(dòng)脈管壁增厚,管腔變窄,腫瘤細(xì)胞有核崩解、核溶解現(xiàn)象。

2.2 雞腎臟及腫瘤組織中NO含量及NOS活性的檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 雞腎臟及腫瘤組織中NO含量的檢測(cè)結(jié)果由表1可知,攻毒加砷組腎臟腫瘤組織中NO含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低,與同一時(shí)間段對(duì)照組比較,35 d組與40 d組間差異極顯著(P＜0.01);與同一時(shí)間段攻毒組比較,40 d組與45 d組差異極顯著(P＜0.01);攻毒加砷組間比較,35 d組與40 d組和45 d組間差異極顯著(P＜0.01)。

表1 雞腎臟及腫瘤組織內(nèi)N O含量的檢測(cè)結(jié)果(μ mol/mg prot)

2.2.2 雞腎臟及腫瘤組織中NOS活性的檢測(cè)結(jié)果 由表2可以看出,各攻毒加砷組腎臟腫瘤組織中T-NOS、iNOS及cNOS活性均隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低。攻毒加砷組腎臟腫瘤組織中NOS活性與同一時(shí)間段對(duì)照組間及攻毒組間差異比較均顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)。

表2 雞腎臟及腫瘤組織中NOS活性的檢測(cè)結(jié)果 (U/mg prot)

2.3 雞腎臟及腫瘤組織中iNOS mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果 由表3及圖1可知,攻毒加砷組腎臟腫瘤組織中iNOS mRNA的表達(dá)水平隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低,與同一時(shí)間段對(duì)照組相比,35 d組和40 d組差異極顯著(P＜0.01);與同一時(shí)間段攻毒組相比,各組均差異極顯著(P＜0.01);攻毒加砷組間比較,各組均差異極顯著(P＜0.01)。

表3 雞腎臟及腫瘤組織內(nèi)iNOS mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果[IOD(iNOS)/IOD(β-actin)]

3 討論

圖1 As2O3對(duì)雞腎臟及腫瘤組織中iNOS mRNA表達(dá)的影響

體外研究表明,As2O3能夠抑制雞MD腫瘤細(xì)胞株 MDCC-MSB1細(xì)胞的增殖,并誘導(dǎo) MDCCMSB1細(xì)胞發(fā)生凋亡[2-3]。新近發(fā)現(xiàn)NO是一種血管形成調(diào)節(jié)因子,與腫瘤的生長(zhǎng)有一定關(guān)系[5]。腫瘤組織可通過(guò)自分泌細(xì)胞因子誘導(dǎo)iNOS的產(chǎn)生,從而調(diào)節(jié)NO的合成[6]。NO可誘導(dǎo)內(nèi)皮的分裂、增生,調(diào)節(jié)腫瘤血管新生,調(diào)控腫瘤血流量[7]。腫瘤細(xì)胞的高生長(zhǎng)率有賴于NO的生成[8],沒(méi)有NO生成腫瘤的生長(zhǎng)將會(huì)因血供的缺乏而受到限制[9]。然而,NO在As2O3發(fā)揮作用時(shí)也起著重要作用,劉瑩等[10]研究表明,As2O3可引起腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織NO生成的減少,進(jìn)而抑制腫瘤生長(zhǎng)。ChouY等[11]研究表明,100 ng/mL的As2O3能夠在1h后使人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)NO含量降低,48h后使eNOS活性降低,而As2O3對(duì)SD大鼠體內(nèi)的NO含量與eNOS活性保持不變。Dulak J等[12]研究顯示,NO可能在促進(jìn)腫瘤血管的生成中發(fā)揮重要作用。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示,馬立克病病雞注射As2O3后病雞癥狀減輕,病理變化變少,特別是腎臟腫瘤改變明顯,表明As2O3能夠一定程度上抑制腎臟腫瘤生成。揭示MD誘發(fā)的腎臟腫瘤組織中NOS活性加強(qiáng),可以增加iNOS的表達(dá),進(jìn)而調(diào)節(jié)NO的合成,NO可促使內(nèi)皮細(xì)胞的分裂、增生,調(diào)節(jié)腫瘤血管新生,促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng),而As2O3能夠通過(guò)降低腫瘤組織中NOS活性,抑制iNOS的表達(dá),降低NO含量,從而發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)和侵襲的目的,揭示NO在As2O3抑制馬立克病雞腎臟腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

[1]Burgess S C,Basaran B H,Davison T F.Resistance to Mare k's disease herpesvirus-induced lymphoma is multiphasic and dependent on host genotype[J].Vet Pathol,2001,38:129-142.

[2]張久麗,王金濤,肖銀霞,等.三氧化二砷誘導(dǎo)雞 MD腫瘤細(xì)胞凋亡及對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響[J].中國(guó)家禽,2008,30(10):21-24.

[3]張久麗,李忠顯,吳立君,等.三氧化二砷對(duì)雞馬立克氏病腫瘤細(xì)胞凋亡的影響[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2008,38(2):137-141.

[4]李金龍,國(guó)琳,劉曉瑛,等.一氧化氮在A s2O3抑制馬立克氏病雞肝臟腫瘤生長(zhǎng)中的作用[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2010,40(1):65-69.

[5]曾毅力,潘敬新.一氧化氮與腫瘤的多重關(guān)系[J].醫(yī)學(xué)綜述,2009,15(11):1644-1646.

[6]朱祖安,劉瑩,費(fèi)素娟.iNOS在胃癌中的表達(dá)及其與微血管密度的關(guān)系[J].徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2005,25(1):3-6.

[7]劉俊林,李漢賢.一氧化氮與腫瘤[J].醫(yī)學(xué)綜述,2007,13(9):667-669.

[8]Jenkins D C,Charles IG,Thomsen L L,et al.Roles of nitric oxide in tumor growth[J].Proc Natl Acad Sci USA,1995,92(10):4392-4396.

[9]Brown J M.S R 4233(tirapazamine):a new anticancer drug exploitinghy poxia in solid tumours[J].Br J Cancer,1993,67(6):1163-1170.

[10]劉瑩,柳紅,孔慶兗.SOD和NOS、NO在As2O3抗S180肉瘤細(xì)胞中的作用[J].徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2005,25(1):8-12.

[11]Chou Y,T sai C H,Ueng K C,et al.Endothelial gap junctions are down-regulated by arsenic trioxide[J].Eur J Pharmacol,2007,569(1-2):29-36.

[12]Dulak J,Józkowicz A,Dembinska-Kiec A,et al.Nitric oxide induced the synthesis of vascular endothelial growth factor by rat vascularsmooth muscle cells[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2000,20(3):659-666.