三氧化二砷對雞馬立克病病毒誘導雞肝臟腫瘤中血管生長相關因子表達的影響

李金龍,國 琳,劉曉瑛,張久麗,3,孫 剛,徐世文

(1.東北農業大學動物醫學學院,黑龍江 哈爾濱150030;2.浙江省余姚市畜牧獸醫局,浙江余姚315400;3.黑龍江畜牧獸醫職業學院,黑龍江 雙城150100;4.黑龍江省動物衛生監督所,黑龍江哈爾濱150090)

雞馬立克病(MD)是世界上第一個能用疫苗成功預防的腫瘤性疾病,因此在腫瘤發生和抗腫瘤治療方面的研究中,MD是一種理想的腫瘤模型[1]。三氧化二砷(As2O3)主要是通過抑制雞MD腫瘤細胞生長和誘導細胞凋亡起抗腫瘤作用[2-3],近年人們又發現As2O3可以通過抑制腫瘤血管生成而發揮抗腫瘤的效果。因此,研究腫瘤血管形成為探尋肝臟腫瘤的治療提供了新策略,但關于As2O3對MDV誘導的雞肝臟腫瘤中血管生長影響的研究未見報道。本研究旨在揭示MD雞肝臟腫瘤中血管內皮細胞生長因子表達情況和As2O3對其影響,探討As2O3抑制MD雞肝臟腫瘤生長的機制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與處理 1日齡伊莎公雞500只(東北農業大學孵化場),隨機分為對照組100只、攻毒組與攻毒加砷組各200只,按常規進行免疫接種(攻毒組與攻毒加砷組不接種馬立克疫苗),隔離飼養,自由采食。對照組,常規飼養;攻毒組與攻毒加砷組在第1天腹腔注射用 Hank's液10倍稀釋的SPF雛雞復壯的MDV京-1株(由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所劉長軍研究員惠贈)新鮮血毒,劑量為0.2 mL/羽。飼養30 d后,攻毒加砷組,每兩日腹腔注射As2O33.0 mg/kg體重,對照組和攻毒組注射等量生理鹽水,連續觀察試驗組雞的臨床表現并記錄。分別于第35、40、45天剖殺試驗雞,進行檢測。

1.2 主要試劑 As2O3注射液(1 mg/mL)由本研究室制備,rTaq DNA聚合酶等PCR反應試劑均購自寶生物工程(大連)有限公司,T rizol試劑盒、MMLV反轉錄酶購自Invitrogen公司。

1.3 臨床觀察及血管組織病理學檢查 記錄各試驗組雞的臨床癥狀,觀察病理剖檢變化,按常規法取對照組肝臟和試驗組肝臟腫瘤組織,固定,制片,H.E.染色觀察。

1.4 雞肝臟及腫瘤組織中血管生長相關因子VEGF、KDR及bFGF mRNA表達的檢測 根據GenBank上VEGF基因序列(序列號AB011078)、KDR基因序列(序列號AY382882)、bFGF基因序列(序列號NM205433)與β-actin基因序列(序列號NM205518),應用Oligo 6.0軟件設計引物,由上海英駿生物技術有限公司合成。VEGF引物(PCR產物 長 度 458bp)上 游:5′-GATGAGATGTGCGGGT TGC-3′, 下 游 :5′-AAATCAGGCTCCAGAAACAG-3′;KDR引物(PCR產物長度428 bp)上 游:5′-GAGTCATAGGCAACGACAC-3′,下游:5′-CAGCTCAACTTGGTAGTG-3′;bFGF 引 物(PCR 產 物 長 度 233bp)上 游:5′-TTCAAGCAGAAGAAAGAGGAG-3′, 下 游:5′-AGGTCCAGTTTTTGGTCCG-3′;β-actin 引物(PCR 產物長度282 bp)上游:5′-ACG TCGCACTGGATT TCGAG-3′下游 :5′-TGTCAGCAATGCCAGGGTAC-3′

應用Trizol試劑盒提取肝臟及腫瘤組織總RNA,并測定 RNA濃度及純度。取總 RNA 5.0 μ g,以加寡脫氧胸苷(Oligo(dT))為引物進行反轉錄反應。取反轉錄產物2 μ L,進行 50 μ L 反應體系PCR擴增。擴增條件為:預變性95℃5 min,變性95℃1 min,退火 58.5℃(VEGF)、54℃(KDR、bFGF與β-actin)、45s,延伸 72℃1 min,30個循環,72℃終延伸 7 min。分別以 VEGF、KDR及bFGF基因與β-actin基因的PCR產物的灰度比值來表示基因mRNA的相對表達水平。

1.5 試驗數據的分析與統計 數據的統計學分析應用SAS軟件與Microsoft Excel 2 000對試驗數據進行統計并作圖。

2 結果

2.1 臨床癥狀觀察及血管組織病理學變化 對照組雞無異常。攻毒組雞表現出MD典型癥狀,如“劈叉”現象,剖檢可見肝臟表面有灰白色粟粒至綠豆大不等的病灶(見圖1,圖2)。攻毒組加砷組雞注射As2O3后,隨著時間的延長癥狀逐漸減輕,剖檢可見肝臟腫瘤出現明顯減少,生成的腫瘤也有明顯減小。

組織學檢查對照組肝臟結構正常。攻毒組病雞肝臟小葉間結締組織中見界限模糊的結節性增生,其周圍血管豐富,有大量血管上皮細胞,肝竇中有部分的彌散性浸潤(見圖3)。攻毒組加砷組病雞肝臟中可見灶狀瘤細胞團,周圍細胞有空泡變,匯管區擴大,周圍血管數量明顯減少,血管上皮細胞脫落、變性,個別出現細胞壞死,周圍結締組織有纖維化(見圖4)。

2.2 雞肝臟及腫瘤組織中VEGF與KDR mRNA表達的檢測結果 見表1。

由表1可知,攻毒加砷組肝臟腫瘤組織內VEGF mRNA表達水平隨時間的延長逐漸降低,與同一時間段對照組比較,各組間均差異極顯著(P＜0.01),與同一時間段攻毒組比較,45 d組差異極顯著(P＜0.01)。攻毒加砷組肝臟腫瘤內KDR mRNA的表達水平隨時間的延長逐漸降低,與同一時間段對照組比較,35 d組間差異極顯著(P＜0.01);與同一時間段攻毒組比較,40 d和45 d組差異極顯著(P＜0.01);攻毒加砷組間比較,35 d與40 d和45 d組間差異極顯著(P＜0.01)。

表1 雞肝臟及腫瘤內VEGF與KDR mRNA表達水平的檢測結果

2.3 雞肝臟及腫瘤組織中bFGF mRNA表達的檢測結果 見表2。

由表 2可知,攻毒加砷組肝臟腫瘤內 bFGF mRNA的表達水平隨時間的延長逐漸降低,與同一時間段對照組比較,各組間差異極顯著(P＜0.01);與同一時間段攻毒組相比,40 d和45 d組間差異極顯著(P＜0.01);攻毒加砷組間比較,各組間差異極顯著(P＜0.01)。

表2 雞肝臟及腫瘤內bFGFmRNA表達水平的檢測結果[IOD(bFGF)/IOD(β-actin)]

3 討論

研究表明VEGF及其受體(VEGFR)在肝臟腫瘤組織中較正常肝組織呈過高表達,與肝臟腫瘤的生長、轉移、復發及治療密切相關[4]。As2O3能夠抑制乳腺腫瘤細胞內VEGF mRNA及VEGF蛋白的表達,且隨 As2O3濃度的增加其抑制作用更明顯[5]。Roboz G J等[6]證實As2O3可直接誘導血管內皮細胞和白血病細胞凋亡,使VEGF表達減少,抑制腫瘤的新生血管生成。bFGF是最重要的多肽類生長因子之一,作為一種強有力的促血管生成劑,具有促進腫瘤細胞轉化為血管生成表型的能力,其在腫瘤發生、發展及轉移中發揮重要作用。Woo S H等[7]研究發現,As2O3能夠明顯的抑制bFGF、VEGF刺激的人臍靜脈上皮細胞增殖,并有劑量依賴性。

本試驗結果表明,MD病雞肝臟腫瘤內VEGF、KDR及bFGF mRNA的表達水平顯著高于正常肝臟組織,As2O3能夠下調腫瘤組織內VEGF、KDR與bFGF mRNA的表達水平,并呈現時間效應;而MD病雞腹腔注射As2O3后,臨床癥狀減輕,肝臟腫瘤數量和大小明顯較少,腫瘤組織周圍血管數量明顯減少,血管上皮細胞脫落、變性,個別出現壞死。揭示As2O3能夠通過下調肝臟腫瘤組織中VEGF、KDR與bFGF mRNA的表達水平,破壞血管內皮細胞的結構和功能,抑制腫瘤細胞轉化為血管生成表型,從而直接抑制腫瘤血管的新生,減少腫瘤的營養供給,對腫瘤的生長起到控制作用,這是As2O3抗腫瘤作用機制之一。

[1]Burgess S C,Young J R,Baaten B J,et al.M arek′s disease is a natural model for lymphomas overexpressing Hodgkin′s disease antigen(CD30)[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(38):13879-13884.

[2]張久麗,王金濤,肖銀霞,等.三氧化二砷誘導雞M D腫瘤細胞凋亡及對細胞內鈣離子濃度的影響[J].中國家禽,2008,30(10):21-24.

[3]張久麗,李忠顯,吳立君,等.三氧化二砷對雞馬立克氏病腫瘤細胞凋亡的影響[J].中國獸醫科學,2008,38(2):137-141.

[4]Fayettw J,Soria J C,Armand J P.T argeting angiogenesis in oncology[J].Pathol Biol(Paris),2006,54(4):199-205.

[5]趙增虎,張建宇,劉秀芳,等.T ACE對原發性肝癌 VEGF和M VD的影響[J].中國誤診學雜志,2007,7(4):717-718.

[6]Roboz G J,Dias S,Lam G,et al.Arsenic trioxide induces dose-and time-dependent apoptosis of endothelium and may exert an antileukemic effectviainhibition of angiogenesis[J].Blood,2000,96(4):1525-1530.

[7]Woo S H,Park M J,An S,et al.Diarsenic and tetraarsenic oxide inhibit cell cycle progression and bFGF-and VEGF-induced proliferation of human endothelial cells[J].J Cell Biochem,2005,95(1):120-130.