補飼硒維生素E對奶牛激素水平的影響

趙金香,陶大勇,楊麗敏

(塔里木大學動物科學學院,新疆阿拉爾843300)

奶牛的生產水平和養殖效益與繁殖性能密切相關,隨著現代育種水平的提高,日糧營養已成為提高奶牛繁殖率的關鍵因素[1]。硒和維生素E是提高奶牛繁殖率和生產力的重要物質,硒是谷光甘肽過氧化物酶的組成成分,可消除脂質過氧化物的毒性作用,從而提高免疫機能[2]。當硒和維生素E缺乏時,母牛出現不規則發情或根本不發情,子宮內膜炎及卵巢囊腫等疾病發病率升高,受胎率低,流產或死胎,所產犢牛體質差等。實踐證明,冬春季節長期缺乏青綠飼料時,給母牛注射亞硒酸鈉,對提高母牛繁殖率有良好的作用。若將硒和維生素E加入飼料中飼喂,也能收到很好的效果(100 kg飼料加入0.022 g無水亞硒酸鈉,同時按每千克飼料加入20～25 IU維生素E)。奶牛配種輸精前后注射亞硒酸鈉和維生素E能明顯提高受胎率[3]。

本試驗對青年荷斯坦奶牛補飼維生素E和硒,觀察奶牛體內相關激素水平的變化及對發情率、發情期受胎率的影響,進一步揭示維生素E和硒對奶牛繁殖性能的影響,為生產實踐提供一定參考。

1 試驗材料

1.1 試驗動物 選擇某奶牛場臨床健康,體重相近,18月齡性成熟的青年荷斯坦奶牛50頭。

1.2 藥物與試劑 維生素E膠丸(上海慶安藥業集團宿州制藥有限公司,產品批號:080106,有效日期至2009年12月),亞硒酸鈉維生素E注射液(重慶希望動物藥業有限公司,產品批號230171115,有效期至2009年8月)。乙醚、甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、0.10 g/L 17α-雌二醇 、對硝基苯甲酰氯乙腈溶液及雙酚 A、4-壬基酚、17α-乙烴基雌二醇、雌三醇、17α-雌二醇、17β-雌二醇等標準溶液。

1.3 儀器設備 高效液相色譜儀(Waters A lliance HPLC 2695)、SinoChrom ODS_BP(4.6 mm ×150 mm,5 μ m)色譜柱、循環水式多用真空泵等。

2 試驗方法

2.1 分組 將供試奶牛隨機分為3組,即對照組(10頭)、試驗 A組(20頭)、試驗B組(20頭)。對照組不補飼藥物,試驗A組補飼維生素E,試驗B組補飼亞硒酸鈉維生素E,見表1。

表1 供試奶牛分組及補飼情況

2.2 血液的采集和處理 頸靜脈采血。對照組采血1次,試驗A組和試驗B組每隔5 d采血1次。分離血清,放入冰箱,備用。

2.3 標準溶液配制 準確稱取雙酚A、4-壬基酚、17α-乙烴基雌二醇、雌三醇、17α-雌二醇、17β-雌二醇(均為Sigma產品)各1.00 mg,于10 mL容量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度線作為標準儲備液,臨用前用甲醇稀釋成10 mg/L混合標準應用液。

2.4 色譜條件 色譜柱:SinoChrom ODS-BP(4.6 mm ×150 mm,5 μ m);流速 :1.0 mL/min;柱溫 :25℃激發波長為228 nm,發射波長為316 nm;進樣量:10 μ L;流動相:乙腈-水 ;系統梯度洗脫:0～ 12 min乙腈由 30%(V/V)增加至70%,在 12～12.3 min,乙腈由70%快速增加至100%,并保持至 20 min;反應衍生化時間為30 min。

2.5 繪制標準曲線 分別取 0.0、10.0、20.0、40.0 μ L和100.0 μ L混合標準應用液,循環水式多用真空泵揮干。各加入0.10 mL對硝基苯甲酰氯乙腈溶液,搖勻后處于暗處放置30 min,再加入0.40 mL 30%乙腈-水,離心后,取上清液進樣。

2.6 樣品處理 吸取待測血清0.50 mL于10 mL具塞管中,加入2.0 mL乙腈沉淀蛋白后,再加入1.0 mL 1 mol/L HCl,1.00 mL甲醇和2.0 mL蒸餾水,用8.0 mL乙醚分3次液液萃取,合并提取液,用循環水式多用真空泵揮干,進行衍生,衍生后的樣品按標準曲線進行測定。

2.7 奶牛的發情及受胎觀察 自補飼維生素E、亞硒酸鈉維生素E后,以20 d為一個觀察期,供試奶牛的發情情況主要以外觀臨床表現為主。是否受胎,以人工授精后2個月直腸檢查為準。

發情表現:陰門紅腫,黏液增多,掉線,有爬跨行為。直檢卵巢有發育較好的卵泡。

3 結果與分析

3.1 流動相組成的選擇 見表2。

表2 流動相組成的選擇

經過多次試驗,最終選擇0～12 min乙腈由30%(V/V)增加至70%,在 12～12.3 min,乙腈由70%快速增加至100%,并保持至20 min。通過梯度洗脫,可以在20 min內同時基線分離6種衍生物。柱溫25℃和流速1.0 mL/min[2]。

3.2 液相色譜圖 見圖1。

3.3 標準曲線的繪制 見表3。以峰面積為縱坐標,以激素含量為橫坐標,通過測定計算出17β-雌二醇 、雌三醇、4-壬基酚 、17α-乙炔基雌二醇、雙酚 A 、17α-雌二醇在線性范圍內,R依次為 0.9988,0.9969,0.9971,0.9972,0.9934,0.9958。

3.4 衍生產物穩定性試驗 將衍生后的溶液分別放置0 h 、1 h 、2 h、4 h 、1 d及 2 d 后測定,結果顯示,在24 h內,衍生產物峰面積無顯著變化。

3.5 血液中各種雌激素含量的變化 見表4。

由表4可以看出,通過補飼維生素E、亞硒酸鈉維生素E后,隨著補飼時間的延長,血液中激素含量持續增加,試驗A、B兩組能測出的雌激素的種類增多;如第1次補飼后,試驗組能測出3種激素,第3次補飼后能測出4種激素,第4次補飼后能測出4～5種激素,而對照組只能測出6種激素中17β-雌二醇和雙酚A兩種,且含量均低于試驗組。經過4次補飼后,17α-乙烴基雌二醇含量仍然較低,未在血液樣品中檢出,如果繼續補飼,預計可檢出。

從試驗組來看,試驗B組中各激素的含量均比試驗A組中的含量高。補亞硒酸鈉維生素E后對各雌激素含量的影響較大(尤其是對17β-雌二醇的影響),補飼效果較好。

從試驗B組的檢測結果來看,長時間補飼亞硒酸鈉維生素E后,血液中雌三醇的含量緩慢升高,至第4次補飼后才得以檢測出,而此時奶牛血液中的雌二醇含量已比較高;第2次補飼后,雌激素含量升高明顯。根據結果分析和從生產實際考慮,補飼3次即可,以2次較為適宜。

表3 6種激素的標準曲線

3.6 補飼維生素E、亞硒酸鈉維生素E后供試奶牛的發情情況 見表5。

由表5可以看出,對照組10頭奶牛均未發情;試驗A組只有1頭奶牛發情,但受胎失敗;試驗B組有4頭發情,其發情率為20%,4頭發情奶牛配種之后,受胎3頭,受胎率為75%。說明補飼維生素E膠丸后有利于促進奶牛發情率的升高;維生素E和硒聯合使用可明顯提高奶牛的發情率和受胎率,對提高母牛發情、情期受胎率有良好的作用。

表4 補飼維生素E、亞硒酸鈉維生素E之后血液中各種雌激素含量的變化

表5 補飼維生素E、亞硒酸鈉維生素E后供試奶牛的發情情況

4 討論

4.1 液相條件的選擇 檢測波長的選擇、衍生化反應條件的選擇、衍生化反應時間的選擇、衍生化反應溫度的選擇參照文獻[2]操作。選擇的激發波長為228 nm,發射波長為316 nm。采用對硝基苯甲酰氯為熒光衍生劑,與6種雌激素在無水環境中發生熒光衍生化反應,生成具有強熒光物質。選擇反應衍生化時間為30 min,溫度為室溫(25℃)。

4.2 17α-雌二醇和17β-雌二醇是兩種同分異構體,在動物體內主要以 17β-雌二醇的形式存在,17α-雌二醇的活性作用比17β-雌二醇弱;4-壬基酚對兩種雌激素有抑制作用;雙酚A對生殖有抑制作用,主要抑制雌二醇,也可使機體免疫能力下降,具有激素樣效應[4-5]。試驗結果顯示,17α-雌二醇和 17β-雌二醇這兩種雌激素和雙酚A的含量在補飼后成百倍地增加,4-壬基酚也有所增加,與試驗前和第1次補飼后測得結果相比,結合奶牛的發情及受胎情況,說明補飼效果較好。

4.3 雌三醇是雌二醇的代謝產物,從試驗B組的檢測結果來看,長時間補飼亞硒酸鈉維生素E后,血液中雌三醇的含量緩慢升高,至第4次補飼后才得以檢測出,說明奶牛血液中的雌二醇含量已比較高,預計再補飼也沒有更大的臨床意義。

[1]鄭剛.營養水平對母牛繁殖能力的影響的探討[J].新疆畜牧業,2006,14(13):45-47.

[2]毛麗莎,孫成均,張宏,等.柱前熒光衍生-高效液相色譜法測定尿和血清中的環境雌激素[J].分析化學,2003,31(12):33-36.

[3]李宗輝.高產奶牛繁殖障礙的發生的原因[J].青海畜牧獸醫雜志,2009,1(2):29.

[4]秦友平,羅永煌.雌二醇不同途徑給藥及其制劑的研究概況[J].廣西醫藥,2006,37(6):4-7.

[5]汪現,翁玲玲,張祖兵,等.17α-雌二醇 3-醚化合物的合成及初步生理活性研究[J].華西藥學雜志,2003,18(1):30-31.