遼東楤木葉總皂苷對荷瘤小鼠抑瘤作用的實驗研究

尹麗穎，邊曉燕，肖洪彬

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

中藥遼東楤木系五加科楤木屬植物，具有補氣安神、強精補腎、祛風活血、除濕止痛之功效。其化學成分以皂苷類為主，總皂苷成分具有抗變態反應、保肝、降血脂、耐缺氧等多種藥理活性［1，2］。本課題組在前期研究中發現，遼東楤木葉的總苷成分還具有較強的抗腫瘤作用［3，4］。因此，采用 H22荷瘤小鼠為研究對象，從形態學角度進一步研究遼東楤木葉總皂苷對抑制癌細胞增殖、誘導細胞凋亡的作用，并闡明其作用機理。

1 材料與方法

1.1 動物與瘤株

清潔級昆明種小鼠30只，體重(20±2)g，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供，雌雄各半;H22腹水型小鼠肝癌細胞由哈爾濱醫科大學腫瘤研究所提供。

1.2 藥物與試劑

遼東楤木葉總皂苷(ETS)由黑龍江中醫藥大學中藥化學教研室提供;環磷酰胺(CTX)由江蘇恒瑞制藥廠生產，批號06111521。

1.3 儀器

荷蘭TECNAIG2型透射電子顯微鏡;德國萊卡超薄切片機;OLYMPUS(COVER－018型)生物顯微鏡。

1.4 動物造模與分組

取體重(20±2)g昆明種小鼠30只，雌雄各半，無菌條件下取第8d轉移癌 H22腹水(計活細胞大于95%)，用0.9%生理鹽水1∶3稀釋后，每只鼠右側腋部皮下注射0.2mL瘤細胞懸液，然后將荷瘤鼠隨機分為三組即模型組、ETS組、CTX組，每組10只。

1.5 給藥方法與劑量

模型組:生理鹽水灌胃 20mL·(kg·d)－1，腹部皮下注射生理鹽水10mL·(kg·d)－1。

ETS組:ETS 灌胃 100mg·(kg·d)－1，腹部皮下注射生理鹽水10mL·(kg·d)－1。

CTX 組:生理鹽水灌胃 20mL·(kg·d)－1，腹部皮下注射 CTX 30mg·(kg·d)－1。

以上各組均在實驗第2d開始用藥，每日1次，連續10d，禁食12h后處死小鼠，剝離瘤組織。

1.6 取材

小鼠斷頸處死后，剝離腫瘤組織，剔凈周圍的結締組織，稱重后迅速分別放入4%多聚甲醛和3%戊二醛固定液中固定。

光鏡樣品制備:常規石蠟包埋，切片，二甲苯脫蠟，HE染色，待光鏡觀察。

電鏡樣品制備:戊二醛前固定，PBS緩沖液沖洗，1%鋨酸后固定，PBS緩沖液沖洗，乙醇、丙酮梯度脫水，環氧樹脂812浸透、包埋、聚合，半薄切片定位，超薄切片，醋酸雙氧鈾、枸櫞酸鉛雙重染色，待透射電鏡觀察。

1.7 觀察指標

瘤體取出后依次稱重，計算抑瘤率，抑瘤率=(對照組平均瘤重－治療組平均瘤重)∕對照組平均瘤重×100%。腫瘤組織的病理形態學及細胞超微結構觀察。

1.8 統計學處理

應用SPSS 14.0軟件進行統計學處理，兩組間比較用t檢驗，結果以(±s)表示。

2 結果

2.1 小鼠瘤質量和抑瘤率 結果見表1。

表1 對H22荷瘤小鼠體內腫瘤生長的抑制情況(±s)

表1 對H22荷瘤小鼠體內腫瘤生長的抑制情況(±s)

注:與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

10 0.94±0.36 ETS組 10 0.43±0.12** 54.3 CTX組 10 0.24±0.09**模型組74.5

2.2 腫瘤病理形態學觀察

模型組:瘤細胞生長旺盛，細胞體積大，核染色深大小不一，病理核分裂相較多，瘤組織內新生微血管豐富。見圖1。

圖1 HE模型組400X

CTX組:腫瘤組織較局限，細胞體積變小，瘤體中央可見片狀壞死，部分可見結締組織包繞，瘤組織內微血管較少見。見圖2。

圖2 HE CTX組400X

ETS組:瘤組織呈小片狀生長，瘤細胞體積較小，大面積壞死核碎裂，瘤體邊緣較整齊，周圍組織少有侵襲，瘤組織內及其周圍微血管明顯減少或偶見。瘤周和間質內有許多淋巴細胞浸潤。見圖3。

圖3 HE ETS組400X

2.3 腫瘤透射電鏡觀察

模型組:瘤細胞多呈圓形或不規則形，排列緊密，間隙正常，細胞表面可見微絨毛豐富，細胞核較大，結構完整，核膜清晰，核仁明顯。見圖4。

圖4 模型組4200×

CTX組:腫瘤細胞大部分發生崩解、壞死現象，細胞膜破裂、不完整，胞質內無明顯細胞器結構，細胞固縮，間隙增寬，呈溶解樣改變。其中可見凋亡細胞，染色質凝集成塊，細胞膜融合。見圖5。

圖5 CTX組4200×

ETS組:瘤細胞體積明顯變小，細胞表面微絨毛減少或消失，核異染色質濃縮成塊，向核周邊凝集，核周隙增寬，可見凋亡小體形成。見圖6。

圖6 ETS組4200×

3 討論

隨著社會和自然環境的變化，惡性腫瘤的發病率逐年升高，已經成為威脅人類生命健康的第二大疾病，全世界每年有600多萬人死于惡性腫瘤。西醫治療腫瘤主要是通過放療、化療、手術等手段，雖然有較好的療效但毒副作用較大，常出現免疫功能下降、骨髓抑制等不良反應，并且化療藥物在治療過程中出現的耐藥性已成為目前臨床治療中的難題之一。因此迫切需要尋求療效好、副作用小的藥物和方法來抵制腫瘤對人類的侵害。腫瘤的發生發展不僅是由細胞增殖失控引起，也與細胞凋亡受阻密切相關。誘導腫瘤細胞的凋亡是抗腫瘤藥物研究及應用的重要策略之一。

本實驗研究結果證明:與模型組比較，CTX組和ETS組瘤重顯著低于模型組的瘤(P<0.01)，表明ETS具有抑制腫瘤細胞生長的作用。形態學觀察結果顯示，CTX組、ETS組均可見腫瘤組織較局限，瘤細胞體積變小，細胞表面微絨毛減少甚至消失，內膜結構完好，核膜清晰，細胞核固縮，染色質團塊狀散布核內或邊集核膜下，并可見不規則凋亡小體，線粒體嵴等細胞器結構未見改變。進一步證明了遼東楤木葉總皂苷的抗腫瘤作用機制可能與誘導腫瘤細胞凋亡密切相關。

［1］孫桂波，徐慧波.去葡萄糖竹節參皂苷IVa對缺氧復氧心肌細胞損傷的保護作用［J］.中國藥理與毒理學雜志，2005，19(6):424－427.

［2］鈕旭升，陶樹青，馬志強，等.遼東楤木的化學成分研究［J］.中醫藥學報，2009，37(3):52－54.

［3］肖洪彬，匡海學.龍牙楤木葉抗腫瘤作用機理的實驗研究［J］.中藥藥理與臨床，2000(增刊):16.

［4］尹麗穎，邊曉燕，肖洪彬，等.遼東楤木葉總皂苷對H22荷瘤小鼠p53及PCNA蛋白表達的影響［J］.中醫藥學報，2010，38(1):18－20.