鐵蛋白與SPIO在磁共振細胞活體示蹤中的增效作用

王建東，胡秋菊，朱飛鵬，常雙會，張 帆，周曉軍，盧光明*

干細胞、祖細胞等多種細胞治療在臨床的應用越來越廣泛[1-6]。無創性活體示蹤接種的治療細胞，對接種細胞的存活、分化以及在損傷的組織器官定位進行長期監控，成為治療成功的關鍵之一。磁共振成像技術(MRI)具有高度時間和空間分辨力，同時可以提供機體解剖和功能方面的信息，目前已經成為活體示蹤細胞的重要手段。超順磁性納米鐵顆粒(superparamagnetic iron oxide, SPIO)標記是磁共振活體示蹤細胞的主要方法，被廣泛應用于基礎科研和臨床前研究[7-12]。但SPIO標記的細胞隨著細胞分裂和鐵顆粒的代謝降解，磁共振信號逐漸減弱，直至消失，無法長期示蹤治療細胞。鐵蛋白廣泛存在于生物細胞內，參與機體鐵代謝，具有儲存鐵的功能。近年來，有關鐵蛋白基因作為磁共振報告基因的研究備受關注[13-16]。其原理是：人工將鐵蛋白基因導入細胞使細胞高表達鐵蛋白，高表達的鐵蛋白將機體細胞外內源性鐵捕獲，在細胞內形成具有超順磁性的結晶鐵，在磁共振下產生對比。但是，鐵蛋白產生的磁共振信號非常弱，很難應用于臨床。本研究探討鐵蛋白與SPIO在細胞內的相互作用，以及在磁共振細胞活體示蹤中的應用。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

鼠膠質瘤C6細胞常規培養于F12 Kaighn's培養基中(Gibico, Invitrogen，美國)，培養基添加1 mM L-谷氨酰胺，15%馬血清(Hyclone, Thermo Scientific，美國)，2.5%胎牛血清(Gibico), 100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素。細胞培養條件為37℃，95%空氣，5% CO2。

1.2 構建鼠鐵蛋白重鏈全基因質粒

應用Trizol試劑(Invitrogen，美國)從小鼠肌肉組織提取總RNA。在Oligo(dT)引物作用下，利用逆轉錄試劑(Promega，美國)將mRNA逆轉成cDNA。根據鼠鐵蛋白重鏈基因序列(GenBank，序列號NM-010239)設計含有NotI 和BamHI限制性內切酶位點的聚合酶鏈式反應(PCR)引物，PCR擴增出鼠鐵蛋白重鏈全基因片段(Fth)。應用NotI和BamHI(大連寶生物公司)對全基因片段和pcDNA3.1(Invitrogen)載體DNA進行消化，通過QIAquck PCR純化試劑盒(QIAGEN，德國)對消化產物進行純化。經T4連接酶(大連寶生物公司)將鐵蛋白全基因插入載體形成鐵蛋白重鏈全基因質粒(Fth-pcDNA3.1)。

1.3 Fth-pcDNA3.1轉染C6細胞

轉染前一天，將105C6細胞接種于500 μl不含抗生素的F12 Kaighn's培養基中，培養于24孔塑料培養板使細胞達到90%融合度。鐵蛋白重鏈質粒FthpcDNA3.1與Lipofectamine 2000(Invitrogen)混合后，在室溫孵育20 min加入細胞培養孔，輕輕混勻培養過夜。轉染24 h后消化細胞進行1:10傳代，加入G418(Gibico)進行篩選，G418終濃度為500 μg/ml。

1.4 細胞免疫化學染色

將轉染鐵蛋白基因質粒的C6細胞和對照C6細胞培養黏附于多聚賴氨酸包被的玻片上。用10%中性福爾馬林固定細胞30 min，PBS緩沖液清洗。特異性兔抗鼠鐵蛋白重鏈的多克隆抗體(Santa Cruz，美國)1:100稀釋后加于細胞上，4℃條件下孵浴過夜。PBS緩沖液清洗，加第二抗體(Dako，丹麥)后，室溫下孵浴30 min。用二氨基聯苯顯色，蘇木精復染細胞核。

1.5 電感耦合等離子波譜儀(ICP)分析

培養細胞和組織細胞中鐵原子濃度利用電感耦合等離子波譜儀(TJA IRIS Advantage/1000 Radial ICAP，Thermo Scientific，美國)分析。培養細胞用0.05%胰蛋白酶－EDTA(Gibico)消化后，加入PBS緩沖液清洗3次。離心后收集細胞。培養的細胞和組織中加入70%濃硝酸，90℃消化1 h,用純水補足體積至5 ml。同時測定純水空白管和含鐵原子0.1、1、10和100 ppm的標準管，鐵原子濃度通過標準曲線計算出。

1.6 活體磁共振掃描

轉染鐵蛋白重鏈質粒的C6細胞和對照C6細胞兩組都標記SPIO。培養細胞中加入SPIO(Ocean Nanotech，美國)使其終濃度為60 μg/ml，輕輕混勻后置37℃的CO2培養箱中培養過夜。培養細胞用PBS緩沖液清洗3次，胰蛋白酶消化后，PBS緩沖液清洗，血球計數板計算細胞數目。將106細胞懸浮在30 μl PBS緩沖液中，置冰上備用。6～10周的裸鼠經異氟烷吸入麻醉后，在兩后腿皮下分別接種細胞。

在細胞接種后不同時間點，進行GE 7 T磁共振掃描。掃描序列為快速旋轉回波(fast spin echo, FSE)T2加權，具體參數為：TR=4000 ms，TE=40 ms，FOV=40 mm，Echo Train Length=8 ms。

1.7 統計學分析

使用SPSS 10.5軟件對數據進行統計學處理，結果以均值±標準差表示，不同組之間的磁共振信號強度，細胞、組織鐵原子濃度之間的差異通過t檢驗分析。P＜0.05認為有統計學意義。

2 結果

2.1 高表達鐵蛋白細胞在體外培養條件下對鐵的攝取

鼠鐵蛋白重鏈基因質粒轉染C6細胞，通過G418進行篩選。應用特異性抗小鼠鐵蛋白重鏈抗體進行細胞免疫化學染色，證實轉染鐵蛋白基因的C6細胞高表達鐵蛋白重鏈(圖1)。

轉染鐵蛋白質粒的C6細胞和對照C6細胞，使用常規F12 Kaighn's培養基培養，細胞的鐵原子來源于15%的馬血清和2.5%的胎牛血清。這兩組細胞內鐵原子的含量，通過ICP檢測發現雖然轉染鐵蛋白基因的細胞鐵原子濃度略高，但兩組之間沒有明顯差異(n=3，P=0.068；圖2A)。

當細胞培養基中加入0.2 mM 枸櫞酸銨鐵(ferric ammonium citrate, FAC)作為細胞外源性鐵時，轉染鐵蛋白基因的C6細胞內鐵原子濃度明顯高于對照組C6細胞(n=3，P=0.001；圖2A)。在培養基中加入不同濃度的FAC時(0.25、0.5、1.0和1.5 mM)，轉染鐵蛋白基因的C6細胞內鐵原子濃度與對照C6細胞相比，都明顯升高(n=3，P=0.004、0.021、0.06和0.012；圖2B)。

圖1 細胞免疫組織化學染色和普魯士藍鐵染色。a:對照C6細胞，b:轉染鐵蛋白重鏈基因C6細胞。利用特異性鼠鐵蛋白重鏈多克隆抗體對細胞進行免疫組織化學染色，轉染鐵蛋白基因的C6細胞胞漿呈現棕黃色，為強陽性。對找組細胞呈淡黃色，為弱陽性。c:對照C6細胞標記SPIO。d:轉染鐵蛋白基因的C6細胞標記SPIO。普魯士藍染色顯示在兩組細胞內都有內吞的鐵顆粒，細胞內的鐵顆粒在兩組細胞間沒有明顯差異Fig 1 . Immunohistochemical stain and Prussian blue iron stain in cells. Immunohistochemical stain was conducted in ferritin transfected and parental C6 cells with a specif i c polyclonal antibody against murine H-chain of ferritin. It showed that a week positive stain (brown particles)in cytoplasm of parental C6 cells (a)and strong positive stain in ferritin transfected C6 cells (b).There was no obvious difference in cellular SPIO label between parental C6 cells (c)and ferritin transfected C6 cells (d)after Prussian blue iron stain.

圖2 細胞和腫瘤組織內鐵濃度測定。a: C6和C6-Fth細胞在普通培養基和加入Fe離子培養條件下，細胞內鐵濃度測定。b: C6和C6-Fth 加入不同濃度Fe離子后培養，細胞內鐵濃度測定。相同顏色表示同樣濃度。c: C6和C6-Fth細胞標記SPIO后連續6次傳代，測定細胞鐵濃度。d: C6和C6-Fth細胞以及標記SPIO后皮下接種裸鼠左右后腿，13天后取組織進行鐵濃度測定Fig 2 . Intracellular iron concentration in C6 cells and xenografts measured by using ICP. (a)There was a minimal increasing of intracellular iron concentration in ferritin transfected C6 cells compared to parental C6 cells (n=3, P=0.684); the ferritin transfected C6 cells accumulated signif i cantly more iron compared to parental C6 cells after incubated with Fe supplement(n=3, P=0.015). (b)Incubating cells with Fe supplement at different concentrations, transfected C6 cells substantially accumulated more iron than parental C6 cells (n=3, P=0.004, 0.021, 0.06, and 0.012, respectively). (c)The transfected and parental C6 cells both labeled with SPIO were passaged successively. C6 cells overexprssed ferritin accumulated signif i cantly more iron than C6 control cells from second passage (n=3, P=0.03, 0.02, 0.004, 0.002, and 0.002 respectively). There was no signif i cant difference at fi rst passage (n=3, P=0.383). (d)No signif i cant difference of the iron concentration was detected between xenografts derived from transfected C6 and parental C6 cells (n=4, P=0.129), while significant difference was showed in xenografts both labeled with SPIO (n=5, P=0.034).

轉染鐵蛋白基因的C6細胞和對照C6細胞兩者標記SPIO后，進行連續傳代，并對每次傳代細胞進行ICP測定細胞內鐵原子濃度。在第一代時，兩組細胞內鐵原子濃度沒有明顯差異(n=3，P=0.383)。但從第二代開始，轉染鐵蛋白基因并標記SPIO的C6細胞，其鐵原子濃度比沒有轉染鐵蛋白基因但標記SPIO的C6細胞的鐵原子濃度明顯增加(n=3，P=0.03、0.02、0.004、0.002和0.002；圖2C)。

圖3 C6SPIO和C6-FthSPIO細胞接種后形成的腫瘤組織病理學檢查和普魯氏鐵染色。 a:C6-Fth 細胞接種后組織學檢查，HE染色顯示腫瘤細胞。b: C6 細胞接種后組織學檢查，HE染色顯示腫瘤細胞。c:C6-Fth SPIO接種后組織鐵染色，藍色顆粒較多。d:C6-Fth SPIO接種后組織鐵染色，藍色顆粒較少。Fig 3 . Xenografts were histologically examined by HE stain (a. ferritin transfected C6 cells with SPIO labeling; b. parental C6 cells with SPIO labeling). Prussian blue iron stain shows that overexpressed ferritin proteins in C6 cells labeled with SPIO accumulate more iron (c)compared to parental C6 cells labeled with SPIO (d).

2.2 高表達鐵蛋白細胞動物活體中對鐵的攝取作用

轉染鐵蛋白基因的C6細胞和對照C6細胞，標記SPIO或者不標記SPIO，分別皮下接種兩組裸鼠后腿兩側。為了探索高表達的鐵蛋白在活體內對內源性鐵和從SPIO降解出鐵原子的捕獲作用，在動物接種細胞后13天處死裸鼠，收集腫瘤組織，稱重后進行ICP組織細胞鐵原子含量分析。轉染鐵蛋白基因但沒有進行SPIO標記的C6細胞來源的腫瘤組織，其細胞內鐵原子含量比與對照C6細胞來源的腫瘤組織相比，雖然濃度略有增加，但沒有明顯差異(n=4，P=0.129；圖2D)。轉染鐵蛋白基因同時標記SPIO的C6細胞來源的腫瘤組織，其細胞內鐵原子的濃度，與標記SPIO的對照C6細胞來源的腫瘤組織相比，明顯升高(n=5，P=0.034；圖2D)。腫瘤組織同時進行病理學檢查和普魯士藍鐵染色。轉染鐵蛋白基因同時標記SPIO的C6細胞來源的腫瘤組織中鐵顆粒比對照C6細胞標記SPIO來源的腫瘤多(圖3)。

2.3 磁共振掃描接種動物

利用GE 7T小動物磁共振儀，采用T2加權序列在腫瘤接種后的第2、6和13天，對裸鼠進行掃描。分析磁共振信號強度，比較實驗組和對照組的差異。轉染鐵蛋白基因而沒有標記SPIO的C6細胞來源的腫瘤，與對照C6細胞來源的腫瘤相比，不同時間點磁共振信號強度差異不明顯(n=4，第2天：P=0.379；第6天：P=0.105；第13天：P=0.056；圖4)。而轉染鐵蛋白基因同時標記SPIO的C6細胞來源的腫瘤，與對照C6標記SPIO來源的腫瘤相比，不同時間點的磁共振信號強度存在明顯差異(n=5，第2天：P=0.012；第6天：P=0.003；第13天：P=0.021；圖4)。

3 討論

由于磁共振具有較高的時間和空間分辨力、無創傷性、可以提供解剖結構信息等優點，它已經被用于干細胞研究的成像[7,10-12,17]。目前磁共振活體示蹤主要是通過細胞內吞超順磁性納米鐵顆粒(SPIO)，利用T2或者T2*序列進行磁共振掃描時產生對比度。SPIO標記細胞后，隨著細胞分裂，細胞內的濃度會逐漸降低。其原理：一是由于SPIO顆粒本身隨著細胞分裂而分裂，物理性稀釋；二是SPIO顆粒與溶酶體等酸性物質結合后，發生化學降解，釋放出游離鐵原子。在分裂較快的細胞，8次傳代后，SPIO顆粒就在細胞內消失了。分裂較慢或不分裂的細胞，在細胞內也只能保留2個月左右。所以，用納米鐵顆粒進行細胞活體示蹤的最大缺陷是無法長期跟蹤接種的治療細胞。鐵蛋白作為細胞本身的一種物質，在機體鐵代謝中主要作用為儲存鐵原子，是一種內源性磁共振報告基因[14-16,18-20]。鐵蛋白攝取內源性鐵形成超順磁性納米鐵產生磁共振信號，由于機體內源性鐵濃度較低，所以依靠鐵蛋白形成的磁共振信號較弱。本研究中，我們首先人工導入鐵蛋白重鏈基因，使C6細胞高表達鐵蛋白，再用SPIO標記該細胞，觀察高表達的鐵蛋白是否能夠將細胞內降解的SPIO鐵原子作為額外鐵源進行攝取，從而增強磁共振信號。

高表達鐵蛋白重鏈基因的C6細胞在體外培養時，如果使用常規培養基，以胎牛血清和馬血清中的鐵為外源性鐵源，培養一定時間后，細胞內的鐵濃度和對照C6細胞相比沒有明顯增加。但如果在培養基中加入枸櫞酸銨鐵作為鐵源，轉染基因的C6細胞比對照組細胞攝取的鐵原子明顯增加，而且隨著外源性鐵濃度增加，細胞內的鐵濃度也增加。這部分體外試驗結果證實，我們構建的鐵蛋白重鏈具有攝取和儲存鐵原子的作用，但如果細胞外鐵濃度低，其攝取儲存鐵的作用無法充分顯示。轉染鐵蛋白重鏈基因的C6細胞和對照C6細胞標記SPIO后進行連續傳代，在第一次傳代，兩者的子細胞內鐵濃度沒有差異，這可能是由于兩組細胞內的鐵濃度非常高，鐵蛋白攝取的鐵與細胞內吞的鐵濃度相差太大，無法顯示。從第二代子細胞開始，兩組細胞內鐵濃度開始產生差異，說明隨著細胞分裂，細胞內的SPIO迅速被稀釋和降解，同時證實在培養條件下，鐵蛋白具有回吸收和利用SPIO降解的鐵功能。

圖4 細胞接種不同時間點進行磁共振掃描。a:C6細胞和轉染鐵蛋白重鏈基因的C6細胞皮下接種裸鼠左右后腿后不同時間點磁共振掃描的T2*信號強度。左側為C6-Fth細胞，右側為C6細胞。b:與a組對應的磁共振圖像。c: C6細胞和轉染鐵蛋白重鏈基因的C6細胞標記SPIO后。皮下接種裸鼠左右后腿后不同時間點磁共振掃描的T2*信號強度。左側為C6-Fth細胞SPIO，右側為C6細胞SPIO。d: 與c組對應的磁共振圖像。Fig 4 . In vivo MRI. C6 cells overexpressing ferritin protein showed minimal reducing signal intensity compared to parental C6 cells at different time points (Figure a; n=4; P=0.379, 0.105 and 0.056 on day-2, 6 and 13, respectively). Overexpressed ferritin proteins in C6 cells labeled with SPIO signif i cantly reduced signal intensity in T2-weighted images for MRI (Figure c; P=0.012, 0.003 and 0.021 on day-2, 6 and 13, respectively). Data are presented as mean ± s.d. Figure b and d shows representative T2-weighted fast spin echo images of xenografts on day2, 6, and 13.

體內實驗結果表明，當高表達鐵蛋白重鏈的C6細胞接種后13天，其腫瘤細胞內的鐵濃度與沒有轉染鐵蛋白基因的C6相比，雖然略有增加，但不明顯。該現象可以解釋為：鐵蛋白重鏈可以攝取一定的內源性鐵，但由于這種鐵濃度非常低，所以鐵蛋白無法在細胞內通過攝取內源性鐵而存儲較多的鐵。當轉染鐵蛋白重鏈基因同時標記SPIO后，C6細胞接種后13天形成的腫瘤細胞，其細胞內鐵濃度比僅標記SPIO的C6細胞明顯增加。我們的研究結果證實，高表達的鐵蛋白可以將SPIO降解的鐵作為額外的鐵源攝取和儲存在細胞內。細胞接種后不同時間點的磁共振掃描信號強度，與細胞內鐵原子濃度結果相符。腫瘤細胞組織普魯士藍鐵染色，進一步證實了這一結果。

本研究證實，鐵蛋白可以與細胞標記的SPIO作用，延長SPIO活體示蹤細胞的時間；同時降解的SPIO可以加強鐵蛋白報告基因的信號強度。兩者聯合使用，可以增強對標記細胞的活體示蹤時間和磁共振信號強度。本研究結果對于進行臨床細胞治療和基因治療，對治療細胞的定位、存活和生長情況實時監測具有一定的應用價值。本研究的局限性在于實驗鼠樣本較少，在待擴大樣本進一步證實的該結論的可靠性。

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