幾丁質酶高產菌的篩選及其產酶條件的優化研究

幾丁質(Chitin)又名甲殼素，廣泛存在于蝦、蟹等甲殼動物的外殼中，是蝦、蟹等甲殼動物可食用部分外的主要廢棄物，自然界每年的產量估計約100億t，是我國近海海域主要的有機污染源之一，同時又是一種用之不竭的生物資源。幾丁質被譽為人體所必需的第六生命要素，其衍生物低分子量幾丁寡糖因具有多種生物活性，可用于治療艾滋病、癌癥及心血管疾病，在口腔醫學和人體保健等領域也有著廣泛的應用[1，2]。幾丁質酶產生菌是一類能利用幾丁質作為碳源而生存、繁殖的特殊的微生物群體，它能通過分泌幾丁質酶降解幾丁質為幾丁寡糖、幾丁二糖直至幾丁單糖，直接被人體吸收利用，從而使幾丁質用途更加廣泛。茂名是一個海濱城市，蝦、蟹資源非常豐富，蝦、蟹殼等廢棄物一直影響著茂名地區的生態環境。作者在此篩選了一株幾丁質酶活力高的菌株并對其產酶條件進行優化，擬為 “漁業垃圾”蝦、蟹等甲殼動物的外殼的再生利用提供理論基礎。

1 實驗

1.1 土樣及試劑

5份土樣采自茂名沿海地區。

幾丁質粉，上海市生物制品有限公司；其它試劑均為國產分析純。

1.2 培養基

平板分離培養基(g·L-1):膠體幾丁質5，K2HPO40.7，KH2PO40.3，MgSO4·7H2O 0.5，FeSO4·7H2O 0.01，瓊脂 15，pH值7.0，蒸餾水定容至1 L。

LB培養基(種子培養基，g·L-1):蛋白胨10，酵母膏 5，氯化鈉10，pH值7.0，蒸餾水定容至1 L。

搖瓶發酵培養基(g·L-1)：細粉幾丁質5，蛋白胨10， K2HPO40.7，KH2PO40.3，MgSO4·7H2O 0.5，FeSO4·7H2O 0.01， pH值7.0，蒸餾水定容至1 L。

1.3 膠體幾丁質的制備

稱取10 g幾丁質粉末，加入40 mL丙酮，充分研磨至糊狀。在低溫下邊研磨邊慢慢加入濃鹽酸400 mL，幾分鐘后，用玻璃棉過濾，在劇烈攪拌下將濾液緩緩加入到劇烈攪拌的50%乙醇(至少是濾液的5 BV以上)中，使膠體幾丁質沉淀析出，離心收集膠體幾丁質，用蒸餾水沖洗幾次，置透析袋過夜,避光保存在冰箱中。

1.4 菌種篩選方法

采用平板稀釋法。取土樣1 g，用無菌水以10倍梯度稀釋成10-1～ 10-6稀釋液，取10-4～10-6稀釋液0.1 mL涂幾丁質平板，在30℃下培養3～5 d。挑取產透明圈直徑與菌落直徑比最大的菌株純化培養并保存待用。

按照常規細菌學方法[3]鑒定到屬。

1.5 產酶條件實驗方法

取30 mL種子培養基置于 250 mL三角瓶中，接入1～2環斜面菌種，30℃、180 r·min-1振蕩培養2 d作為種子。以2%接種量接入各個實驗的培養基中，除另有說明外，產酶實驗條件均為30℃、180 r·min-1培養72 h，每一實驗3次平行。發酵培養液經過4層紗布過濾，再于6000 r·min-1離心10 min，除去沉淀,得粗酶液，測定酶活力。

采用L9(34)正交實驗優化產酶條件，正交實驗的因素與水平見表1。

表1 正交實驗的因素和水平

1.6 酶活力測定方法

酶活力測定用DNS法[4,5]。取1 mL發酵上清液加入1 mL含1%膠體幾丁質的磷酸緩沖溶液(pH值7.0)，50℃保溫 1 h，加入1 mL 3，5-二硝基水楊酸試劑中止反應，沸水浴5 min，冰浴冷卻，離心后取上清

液通過紫外分光光度計在波長200～700 nm范圍內全波掃描，得到最大吸收波長為470 nm。以不含膠體幾丁質的上清液為對照，測吸光度，根據標準曲線計算產生的N-乙酰氨基葡萄糖 (NAG)的量。

酶活單位定義：在特定條件下，每分鐘水解幾丁質產生相當于1 μmolN-乙酰氨基葡萄糖的還原糖所需的酶量。

2 結果與討論

2.1 產幾丁質酶菌株的篩選與初步鑒定

實驗分離得到4株產透明圈較大的菌株，選取產生透明圈最大(透明圈與菌落直徑比2.16)、最穩定的一株命名為X，其菌落圓形，淡黃色，不透明，中央凸起，邊緣整齊(圖1a)。在顯微鏡下觀察，該菌為短桿狀，長0.7～1.0 μm，無鞭毛(圖1b)，該菌的芽孢形態為圓形或卵圓形(圖1c)。

圖1 菌株X的菌落形態和透明圈(a)、顯微鏡下的形態(b)、芽孢在顯微鏡下的形態(c)

菌株X的生理生化特征見表2。

表2 菌株X 的生理生化特征

綜合圖1、表1結果可知，菌體直桿狀，革蘭氏陽性，長0.7～1.0 μm，無鞭毛不可運動，好氧型，菌落形態為圓形，淡黃色，不透明，菌落邊緣整齊，中間隆起，接觸性酶反應陰性，V-P和甲基紅試驗呈陰性，有芽孢及營養體。糖酵解反應中產酸不產氣，符合短芽孢桿菌屬(Brevibacillusshida,Agri,1996)[3]的一般特征。

2.2 培養時間對菌株X產酶的影響

以2%接種量接種于發酵培養基，培養至24 h開始，每隔12 h取樣品測酶活，結果見圖2。

圖2 培養時間對菌株X產酶的影響

由圖2可知，菌株X產酶活性在培養72 h 時達到最大值，此后隨著培養時間的延長，酶活迅速下降。后續實驗均培養至72 h測定酶活。

2.3 溫度對菌株X產酶的影響

以2%接種量接種于發酵培養基，分別在25℃、30℃、35℃、40℃下培養72 h，測酶活，結果見圖3。

圖3 溫度對菌株X產酶的影響

由圖3可知，菌株X在30～35℃溫度范圍內產酶活性較高，且較穩定。最適產酶溫度在30℃，酶活達1.02 U·mL-1，在40℃時菌株產酶活性最低。表明菌株X較適宜在低溫環境中產酶，過高的溫度會抑制其產酶活性。

2.4 初始pH值對菌株X產酶的影響

以2%接種量接種于初始pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的發酵培養基中，培養72 h，測酶活,結果見圖4。

圖4 初始pH值對菌株X產酶的影響

由圖4可知，菌株X在初始pH值為7.0時產酶活性達到最大，酶活達1.08 U·mL-1，其次是pH值為8.0，表明菌株比較適合在弱堿性環境中產酶，這與許多文獻報道相一致[6，7]。pH值為4.0時產酶活性最低，可能是因為pH值過低會抑制菌株的產酶活性。

2.5 氮源對菌株X產酶的影響

以2%接種量接種于以細粉幾丁質為唯一碳源，分別以2%蛋白胨、2%牛肉膏、2%硫酸銨、2%硝酸銨為氮源的發酵培養基中，培養72 h，測酶活，結果見圖5。

圖5 氮源對菌株X產酶的影響

由圖5可知，菌株X在以蛋白胨為氮源的培養基中產酶情況最好，酶活達1.10 U·mL-1。其次是牛肉膏。以硫酸銨、硝酸銨為氮源時產酶較差，說明菌株X在有機氮源中易產酶，特別是對蛋白胨的利用率最高，卻不能較好地利用無機氮源。

2.6 碳源對菌株X產酶的影響

以2%接種量接種于以蛋白胨為唯一氮源，分別以2%細粉幾丁質、2%膠體幾丁質、2%葡萄糖、2%淀粉為碳源的發酵培養基中，培養72 h，測酶活，結果見圖6。

圖6 碳源對菌株X產酶的影響

由圖6可知,菌株X在不同碳源的培養基中均可產酶，以細粉幾丁質、膠體幾丁質為碳源時產酶較好，其中以細粉幾丁質為碳源時最好，酶活達1.08 U·mL-1，而以葡萄糖和淀粉為碳源時產酶效果較差。這可能是因為細粉幾丁質或膠體幾丁質可作為菌株生長所需的碳源。說明該菌株所產的幾丁質酶為一種誘導酶，幾丁質或其衍生物可以充當誘導物[8]。而葡萄糖可能有阻遏作用。

2.7 菌株X產酶條件的優化

在單因素優化實驗的基礎上，設計了L9(34)正交實驗對最佳產酶碳源(細粉幾丁質)、氮源(蛋白胨)、初始pH值和溫度之間的交互作用做了進一步的研究。正交實驗的結果與分析見表3。

表3 正交實驗結果與分析

由表3可以看出，各因素對產酶影響大小依次為D>C>A>B,即影響最大的是碳源,其次是氮源,再次是溫度,最小是pH值。可能是由于碳源、氮源都是菌株產酶所必需的物質，所以影響最大。菌株X的最適產酶組合為A1B2C1D2，即溫度為30℃、pH值為7.0、細粉幾丁質10 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1。

2.8 優化條件下菌株X的產酶活性

取培養2 d的菌種的種子培養液，按2%的接種量接入以10 g·L-1細粉幾丁質為唯一碳源、10 g·L-1蛋白胨為唯一氮源的發酵培養液中，在pH值7.0、30℃、180 r·min-1條件下振蕩培養72 h，發酵培養液經過4層紗布過濾再于6000 r·min-1離心10 min，除去沉淀,得粗酶液，測得酶活為1.24 U·mL-1、1.25 U·mL-1、1.25 U·mL-1，平均酶活約1.25 U·mL-1，比條件優化前有較大提高。

3 結論

(1)通過平板透明圈法初篩、復篩，從土壤中獲得一株透明圈最大(透明圈與菌落直徑比2.16)、最穩定的菌株X。根據菌株和菌落的形態以及生理生化特征，初步判斷該菌為短芽孢桿菌屬(Brevibacillusshida.Agri)。

(2)菌株X培養72 h 時產酶達高峰。單因素實驗和正交實驗表明，各因素對產酶的影響大小依次為碳源>氮源>溫度>pH值,即影響最大的是碳源,其次是氮源,再次是溫度,最小是pH值。菌株X產幾丁質酶的最佳條件為：溫度30℃、pH值7.0、細粉幾丁質10 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1。在此優化條件下幾丁質酶活達1.25 U·mL-1。

參考文獻：

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