超聲法提取藏藥唐古特烏頭中多糖的研究

藏藥唐古特烏頭為毛茛科植物唐古特烏頭[Aconitumtanguticum(Maxim.)Stapf]的干燥全草。夏末秋初開(kāi)花期連根采挖，除去雜質(zhì),陰干。具有清熱解毒、生肌收口、燥濕的功能。主治傳染病引起的發(fā)熱、肝膽熱病、血癥、胃熱、瘍瘡、蛇蝎咬傷以及黃水病[1]。

多糖類物質(zhì)廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞壁中，是生命有機(jī)體的重要組成部分，是除核酸和蛋白質(zhì)以外的又一類重要的生物分子。研究表明多糖類物質(zhì)具有多種生物活性，如抗腫瘤、免疫、降血糖和抗病毒等，而且對(duì)機(jī)體幾乎無(wú)毒副作用[2～5]。

作者在此研究了藏藥唐古特烏頭中多糖的最佳提取條件，用硫酸-苯酚法測(cè)定唐古特烏頭中多糖的含量，以期為唐古特烏頭的進(jìn)一步研究和資源開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 藥材、試劑和儀器

藏藥唐古特烏頭Aconitumtanguticum(Maxim.)Stapf(青海亞郎藏藥材公司)，洗凈，干燥,備用。

苯酚、葡萄糖(上海試劑三廠)、無(wú)水乙醇、濃硫酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

譜析T6型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)； 上海安亭TDL-40B型離心機(jī)； 上海亞榮RE52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；天津泰斯特DK98-1型數(shù)顯恒溫水浴。

1.2 方法

1.2.1 藏藥唐古特烏頭多糖的提取

1.2.1.1 石油醚脫脂

稱取5.0 g 藏藥唐古特烏頭樣品于燒瓶中，加入100 mL 石油醚(沸程60～90℃)，在80℃的水浴中回流提取40 min，冷卻，離心，回收石油醚，重復(fù)2次，將脫脂后的藏藥唐古特烏頭殘?jiān)鼡]干溶劑，備用。

1.2.1.2 回流提多糖

將脫脂后的藏藥唐古特烏頭粉碎至一定粒度，加入一定量蒸餾水，超聲提取一定時(shí)間，冷卻，4000 r· min-1離心5 min，抽濾，收集濾液，再將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮。

1.2.1.3 Sevage法除蛋白

將濃縮的多糖溶液倒入錐形瓶中，加入三氯甲烷-正丁醇(5∶1)混合溶液20 mL，劇烈振蕩20 min，離心，收集上層溶液，重復(fù)操作，至離心后無(wú)蛋白質(zhì)沉淀出現(xiàn)、通過(guò)紫外光譜檢測(cè)無(wú)蛋白質(zhì)吸收為止(本實(shí)驗(yàn)重復(fù)7次)。

1.2.1.4 乙醇沉淀多糖

將離心后的上層清液分別轉(zhuǎn)入量筒中,測(cè)量體積，按1∶6的體積比加入無(wú)水乙醇，得到乙醇含量為80%的一系列多糖混合溶液，靜置過(guò)夜，抽濾，濾渣真空干燥，得到藏藥唐古特烏頭多糖產(chǎn)品。

1.2.2 提取條件的優(yōu)化

根據(jù)藏藥唐古特烏頭中多糖的極性大等特點(diǎn)，以提取液中多糖含量為優(yōu)化指標(biāo)，對(duì)提取時(shí)間、料液比(質(zhì)量比，下同)和藥材粒度等3個(gè)因素進(jìn)行考察，每個(gè)因素取3個(gè)水平，根據(jù)L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，因素與水平見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平

1.2.3 多糖含量的測(cè)定

1.2.3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

多糖含量的測(cè)定有硫酸-蒽酮法和硫酸-苯酚法等，研究表明硫酸-苯酚法的穩(wěn)定性高于硫酸-蒽酮法[6]。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，精密吸取1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，置于50 mL 燒杯中，加入4%的苯酚溶液1 mL，振蕩搖勻，然后加入7 mL 濃硫酸并搖勻。顯色35 min。置于比色皿中，在波長(zhǎng)400～600 nm之間測(cè)定吸收光譜，確定最大吸收波長(zhǎng)為486 nm。

1.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取干燥至恒重的葡萄糖100 mg，加適量蒸餾水溶解、定容至100 mL，作為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。精確量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL和10.0 mL，分別定容至100 mL，再分別取1 mL于50 mL燒杯中，加入4%的苯酚溶液1 mL，振蕩搖勻，然后加入7 mL 濃硫酸并搖勻。顯色35 min。在486 nm處測(cè)量吸光度值，以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)、濃度c(μg· mL-1)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為：A=0.0054c+0.1417，R=0.9942。

1.2.3.3 藏藥唐古特烏頭提取液中多糖含量的測(cè)定

多糖產(chǎn)品用蒸餾水溶解，定容至500 mL，即為待測(cè)樣液。吸取1.0 mL樣液于100 mL容量瓶中，按1.2.3.2方法測(cè)得其吸光度值，由回歸方程計(jì)算藏藥唐古特烏頭提取液中多糖的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳提取條件的確定

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表2。

2.1.1 直觀分析

由表2可知，各因素對(duì)藏藥唐古特烏頭中多糖提取的影響大小依次為：A>B>C,即料液比>提取時(shí)間>藥材粒度，料液比對(duì)提取液中多糖含量的影響較大，藥材粒度相對(duì)較小，各因素的最優(yōu)水平組合為A3B2C2，即藥材粒度為8目、料液比為1∶16、超聲提取2 h。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.2 方差分析(表3)

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果

由表3方差分析數(shù)據(jù)可知，因素A對(duì)指標(biāo)有顯著影響，因素C無(wú)顯著影響，這與直觀分析結(jié)果基本一致。

2.2 工藝條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了考察最佳提取條件的穩(wěn)定性，按該工藝條件進(jìn)行3次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果/%

由表4可知，藏藥唐古特烏頭提取液中多糖的平均含量為4.03%，RSD為0.16%，均優(yōu)于正交實(shí)驗(yàn)表中的任何一組，說(shuō)明該工藝穩(wěn)定可行。

3 結(jié)論

通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)，確定超聲法提取藏藥唐古特烏頭中多糖的最佳提取條件為：唐古特烏頭和水的質(zhì)量比1∶16、超聲提取2 h、藥材粒度8目,在此條件下，提取液中多糖含量可達(dá)4.03%。該方法提取得率較高、穩(wěn)定性好，可為藏藥唐古特烏頭藥效的進(jìn)一步研究和資源開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國(guó)家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會(huì).中華本草[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,2001:307.

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[3] 孫玉書(shū),畢力夫,蘇秀蘭，等.多糖及多糖類藥物研究概況[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2006,28(1):75-78.

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