富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白在病理性瘢痕中的表達及其意義

劉超華 李小靜 寧金龍 王 春

富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白在病理性瘢痕中的表達及其意義

劉超華 李小靜 寧金龍 王 春

目的觀察富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白（Secreted protein,acidic and rich in cysteine，SPARC）在瘢痕疙瘩和增生性瘢痕中的表達規律及其意義。方法瘢痕患者的瘢痕疙瘩和3～12個月增生性瘢痕組織各26例；另取手術剩余的正常成人皮膚組織5例；所有標本用40 g/L甲醛固定，行連續切片，厚4 μm，應用鏈菌素生物素-過氧化物酶標記物免疫組織染色法染色。同時設正常對照（正常皮膚）、陽性對照（胃癌癌變組織）、陰性對照（磷酸鹽緩沖液代替一抗）。鼠抗人SPARC單克隆一抗濃度為1∶200。結果正常成人皮膚中SPARC表達稀少，局限在真皮-表皮交界的乳頭真皮，部分靠近基底膜血管和皮膚附件。SPARC在增生性瘢痕的真皮瘢痕組織、皮膚附件中低表達，且早期增生性瘢痕中表達無明顯強于晚期增生性瘢痕（P＞0.05）。在真皮中SPARC呈彌散性散在分布（同增生性瘢痕），陽性信號表達較低。增生性瘢痕及瘢痕疙瘩的SPARC較正常皮膚表達無差異（P＞0.05）。結論SPARC在3～12個月增生性瘢痕中呈低表達，在瘢痕疙瘩中低表達。

瘢痕疙瘩富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白增生性瘢痕表達

病理性瘢痕包括增生性瘢痕（Hypertrophic scar，HS）和瘢痕疙瘩（Keloid），是人體創傷、炎癥、燒傷或自發的一種過度的皮膚纖維增生性疾病。其組織學特點為大量成纖維細胞增生，細胞外基質中膠原、蛋白多糖、糖蛋白等過度沉積，膠原纖維排列紊亂。富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白（Secreted protein,acidic and rich in cysteine，SPARC），是一種與基質相聯系的糖蛋白，屬于細胞母蛋白家族[1]?，F有研究證明，其在多種纖維化疾?。ㄈ绶卫w維化[2]、肝纖維化[3]、腎纖維化[4]及心肌纖維化[5]）過程中起重要作用，并參與系統性硬化癥的發生[6]及創傷愈合的過程[7]。此外，SPARC在幾種惡性腫瘤中亦有過度表達[10]，如乳癌、食管癌、胃癌、結直腸癌、黑色素瘤等，并且其表達增高的程度與浸潤能力成正比。因其在創傷愈合、纖維化疾病、瘢痕和腫瘤形成中起重要作用，SPARC正逐漸引起人們的廣泛關注。

我們以免疫組化技術對SPARC在病理性瘢痕和正常皮膚組織中的表達進行觀察，旨在研究發現其中的差異，以揭示SPARC在瘢痕形成機制中的可能作用，以期更好地認識病理性瘢痕的發生機制，為預防和治療病理性瘢痕提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

本實驗所用標本取自我院患者。其中增生性瘢痕26例（按損傷后3個月、6個月、9個月、12個月不同時間分組編號），其中男16例、女10例，年齡4～66歲，標本分別取自面部、頸部、胸部、肩部及四肢；瘢痕疙瘩26例，其中男11例、女15例，年齡12～55歲，標本分別取白面部、頸部、胸部、肩部及四肢；正常皮膚5例，其中男4例、女l例，年齡3～65歲，標本分別取自面部、頸部、胸部、肩部及四肢。各組年齡、性別差異均無統計學意義（P＞0.05）。瘢痕組織取材前，患者均未經任何藥物治療，且取材部位無破潰、感染、腫瘤等其他疾病[8]。

1.2 試劑及儀器

一抗（Santa cruz公司，美國）；二抗及SP試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；PBS緩沖液（北京中山金橋技術有限公司）；枸櫞酸鹽緩沖液（武漢博士德生物工程有限公司）；多聚賴氨酸（北京中山金橋技術有限公司）；倒置相差顯微鏡（奧林巴斯映像銷售有限公司）；數顯電恒溫水槽（上海精宏實驗設備公司）；恒溫培養箱（上海精宏實驗設備公司）；分析天平（上海精科天平廠）；移液器（Eppendorf公司，德國）；切片機（上海一恒科技公司）；低溫冰箱（三洋制冷設備公司，日本）；純水機（Labconco公司，美國）；恒溫干燥箱（上海一恒科技公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組織化學染色法

主要步驟包括：①多聚賴氨酸抗脫片處理。②切片用二甲苯脫脂，梯度乙醇和蒸餾水水化。③體積分數為0.03的過氧化氫室溫5～10 min，封閉內源性過氧化物酶，蒸餾水洗3次。④滴加正常血清封閉液，室溫20 min，甩去多余液體，不洗。⑤滴加適當稀釋的鼠抗人SPARC一抗（1∶200）50 mL，37℃1 h孵育，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液洗2 min，3次。⑥滴加生物素羊抗鼠IgG，37℃，20 min，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液洗2 min，3次。⑦滴加試劑鏈菌素生物素一過氧化物酶標記物37℃，20 min，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液洗5 min，4次。⑧室溫控制下二氨基聯苯胺顯色，顯色時間8 min，蒸餾水洗滌。⑨蘇木精輕度復染，脫水、透明、封固，鏡下觀察。

1.3.2 綜合染色強度和陽性細胞數分級

SP法染色后鏡下觀察。取表達最強的部位，按著色程度評分：基本未著色、染色與背景相似者為0分；著色淺、略高于背景者為1分；中度著色、明顯高于背景者為2分；深度著色者為3分。按陽性細胞數評分：陽性細胞數少于25%為0分；陽性細胞數達25%～49%為1分；50%～75%為2分；超過75%為3分。兩項相加后，0～1分為（-），2分為（+），3～4分為（++），5分以上為（+++）。

1.4 統計學處理

應用SPSS 10.0統計軟件。用X2檢驗和方差分析處理數據。

2 結果

SPARC在正常皮膚表皮中呈陰性表達；在真皮內分布于真皮-表皮交界的乳頭真皮處，呈少量、不連續、斑點樣表達（圖1）。

在增生性瘢痕表皮中SPARC表達均呈陰性；在增生性瘢痕真皮組織中SPARC呈散在分布，主要見于成纖維細胞、膠原纖維、平滑肌細胞、皮膚附件、浸潤的炎性細胞和微血管內皮細胞（圖2）。增生性瘢痕真皮中，SPARC的表達與正常皮膚組無明顯差異（P＞0.05）（表1）。增生性瘢痕組中，損傷后3～6個月與9～12個月的標本無明顯差異（表2）。

SPARC在瘢痕疙瘩表皮中呈陰性表達；在真皮中，SPARC同在增生性瘢痕一樣呈彌散性散在分布，陽性信號表達較低（圖3），其表達強度略高于正常皮膚組，但無統計學意義（P＞0.05）。增生性瘢痕與瘢痕疙瘩的差別亦無統計學意義（P＞0.05）（表1）。

圖1 SPARC在正常皮膚中的表達（400×）

圖2 SPARC在增生性瘢痕中的表達（400×）

圖3 SPARC在增生性瘢痕疙瘩中的表達（400×）

表1 SPARC在不同組織真皮中的表達情況

表2 SPARC在增生性瘢痕不同時期的表達情況

3 討論

SPARC廣泛存在于人體組織中，最初是作為非膠原成分被描述和純化的[9]。隨后的研究表明，SPARC在人體中分布廣泛，尤其是在發育和重建中的組織。體內、外實驗表明，它能影響多種細胞的活動，SPARC及其相關的肽與細胞外基質結合，影響細胞外基質的表達，改變細胞形態變化，降低細胞的黏附性，影響細胞的遷移，調節生長因子誘導的細胞增殖及血管發生[1，10]。這些功能同器官纖維化、創傷愈合、腫瘤以及皮膚纖維化的發生發展密切相關[10-11]。

在實驗中我們發現，SPARC能在浸潤的炎性細胞和微血管內皮細胞中表達，我們推測外傷、炎癥刺激可促進內皮細胞表達SPARC，表達于血管內皮細胞上的SPARC參與淋巴細胞與血管內皮細胞間的相互作用，增強白細胞與血管內皮細胞間的黏附，從而促進炎癥的發生與發展。SPARC在病理性瘢痕組織中的低表達，提示血管內皮細胞處于激活狀態，病理性瘢痕組織中有持續的炎癥反應存在，這種持續的炎癥反應可能和組織的過度修復、瘢痕增生有關。

SPARC能影響細胞外基質的表達，Thomas等[12]使用博萊霉素誘導的肺纖維化小鼠動物模型來闡述SPARC同膠原蛋白之間的關系及SPARC調控肺纖維化的發展，結果表明無SPARC的小鼠Ⅰ型膠原蛋白含量明顯低于野生型小鼠，并進一步指出肺損傷后SPARC和Ⅰ型膠原蛋白同時增加。SPARC在創傷愈合膠原纖維產生中起重要作用，能通過調控Ⅰ型前膠原以調節SPARC與細胞外基質的關系，進而改變創傷的愈合[13-15]。我們推測，在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩纖維化進程中，SPARC進行高水平轉錄，進而翻譯成蛋白質，后者刺激組織中成纖維細胞的增殖和以膠原為主的細胞外基質的沉積，增殖的成纖維細胞又會產生更多的SPARC，如此反復循環，最終形成大量的纖維化組織，導致瘢痕增生；SPARC也可能通過各種細胞因子及蛋白酶相互作用來促進膠原蛋白的生成如轉化生長因子（TGF）、結締組織生長因子（CTGF）及熱休克蛋白47等[16]。本實驗提示，在增生性瘢痕真皮組織中SPARC呈彌散分布，陽性信號表達較低；在瘢痕疙瘩真皮中SPARC呈彌散性散在分布，陽性信號表達較低。這與瘢痕組織真皮層成纖維細胞過度增殖和細胞外基質過度沉積的主要病理改變不相吻合。因此，SPARC在病理性瘢痕的發病機制中起的作用及作用過程，需要通過對病理性瘢痕、正常皮膚來源的成纖維細胞進行離體培養，檢測其SPARC分子水平表達的差異情況，來進一步進行深入研究。

[1]Phan E,Ahluwalia A,Tranawski AS.Role of SPARC-matricellular protein in pathophysiology and tissue injury healing.implications for gastritis and gastric ulcers[J].Med Sci Monit,2007,13(2):25-30.

[2]Thomas HB,Gretchen B,Marina C,et al.SPARC regulates extracellular matrix organization through Its modulation of integrinlinked kinase activity[J].J Biological Chemistry,2005,280(43): 36483-36493.

[3]Kazuki N,Shuichi S,Norifumi K,et al.Expression of SPARC byactivated hepatic stellate cells and its correlation with the stages of fibrogenesis in human chronic hepatitis[J].Virchows Arch, 2002,441(5):466-474.

[4]Taneda S,Pippin JW,Sage EH,et al.Amelioration of diabetic nephropathy in SPARC-null mice[J].J Am Soc Nephrol,2003,14 (4):968-980.

[5]Amy DB,Catalin FB,Tyler JR,et al.Role of SPARC in postsynthetic collagen processing in the aging myocardium[J].J Cardiac Failure,2007,13(1):114-123.

[6]Zhou X,Tan FK,Guo XJ,et al.Attenuation of collagen production with small interfering RNA of SPARC in cultured fibroblasts from the skin of patients with scleroderma[J].Arthritis&Rheumatism, 2006,54(8):2626-2631.

[7]Amy DB,May JR,Helene S.SPARC-null mice exhibit accelerated cutaneous wound closure[J].J Histochem&Cytochem,2002,50(1): 1-10.

[8]Berman B,Flores F.The treatment of hypertrophic scars and keloids [J].Eur J Dermatol,1998,8(4):591-595.

[9]Lane TF,Sage EH,1994.The biology of SPARC,a protein that modulates cell-matrix interactions[J].FASEB J,1994,8(2):163-173.

[10]Podhajcer OL,Benedetti LG,Girotti MR,et al.The role of the matricellular protein SPARC in the dynamic interaction between the tumor and the host[J].Cancer Metastasis Rev,2008,27(3): 523-537.

[11]Tai IT,Tang MJ.SPARC in cancer biology:its role in cancer progression and potential for therapy[J].Drug Resist Updat,2008, 11(6):231-246.

12Thomas PS,David KM,Daniel JW,et al.Collagen accumulation is decreased in SPARC-null mice with bleomycin-induced pulmonary fibrosis[J].Am J Physiol,1999,277(3):628-635.

[13]Wang H,Fertala A,Ratner BD,et al.Identifying the SPARC binding sites on collagen I and procollagen I by atomic force microscopy [J].Anal Chem,2005,77(21):6765-6771.

[14]Tyler JR,Felicitta P,Paul B,et al.SPARC regulates processing of procollagen I and collagen fibrillogenesis in dermal fibroblasts [J].J Biological Chemistry,2007,282(30):22062-22071.

[15]Giudici C,Raynal N,Wiedemann H,et al.Mapping of SPARC/ BM-40/osteonectin-binding sites on fibrillar collagens[J].J Biol Chem,2008,283(28):19551-19560.

[16]Martinek N,Shahab J,Sodek J,et al.Is SPARC an evolutionarily conserved collagen chaperone[J]?J Dent Res,2007,86(4):296-305.

The Expression and Significance of Secreted Protein,Acidic and Rich in Cysteine in Hypertrophic Scar and Keloid Tissue

LIU Chaohua,LI Xiaojing,NING Jinlong,WANG Chun.Department of Plastic Surgery,First Affiliated Hospital of Anhui Medical University,Hefei 230022,China.Corresponding author:LI Xiaojing.

ObjectiveTo investigate the expression and significance of Secreted protein,acidic and rich in cysteine (SPARC)in keloid and hypertrophic scar(HS).MethodsTissue samples were harvested from 26 patients with keloid and 26 with HS(3-12 months)and 5 from the skin of healthy adults.All specimens were fixed in 40 g/L formalin.Then the specimens were continuously sliced into 4 μm thick sections.These sections were stained by streptoavidin-biotion method of immunohisto-chemistry.The other groups were normal control(normal skin),positive control(gastric cancerous tissue)and negative control(phosphate buffer)instead of The first antibody.The concentration of Rat anti-human SPARC monoclonal antibody were 1∶200.ResultsThere was scarce expression of SPARC in the skin tissue of healthy adults,and it was only present in the dermal papillae at the dermis epider-mis conjunctions and partly in the blood vessels and skin appendages adjacent to the basement membrane.There was low expression of SPARC in the dermal scar tissue and skin appendages in HS.Also,early expression of hypertrophic scar sputum.There was no significantly difference in the expression between late hypertrophic scar(P＞0.05).SPARC showed scattered diffuse distribution as the same in the hypertrophic scar,and the lower expression of positive signals in the keloid.Compared with that in normal skin,there was no significant difference in the SPARC expression between HS and keloid(P＞0.05).ConclusionThere was lower SPARC expression in HS(3-12 months), and lower expression in keloid.

Keloid;Secreted protein,acidic and rich in cysteine(SPARC);Hyperplastic scar(HS);Expression

Q786

A

1673-0364（2010）01-0017-04

2010年1月8日；

2010年2月5日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.01.005

安徽省自然科學基金（070413102）。

230022安徽省合肥市安徽醫科大學第一附屬醫院整形外科。

李小靜。