人鼻咽癌細胞系中基質金屬蛋白酶9的表達及意義*

劉 濤，謝民強

（1.廣州中山大學附屬第三醫院 耳鼻咽喉頭頸外科，廣東 廣州510630；2.廣州南方醫科大學珠江醫院 耳鼻咽喉頭頸外科，廣東 廣州510282）

鼻咽癌是中國南方常見的一種高轉移性的惡性腫瘤，往往在疾病的早期即發生組織侵襲和轉移，但其生物學機制仍不清楚[1]。

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）是基底膜及細胞外間質的蛋白水解酶，能促進惡性腫瘤浸潤和轉移[2]。其中，MMP家族成員中的MMP9主要降解Ⅳ型膠原，使基底膜破壞，啟動腫瘤細胞侵襲的起始階段[3]。雖然有研究發現，人鼻咽癌組織中MMP9高表達可能與鼻咽癌侵襲和轉移相關[4～6]，但具體機制尚不清楚。為進一步明確鼻咽癌細胞中MMP9基因在體內和體外表達有無差別，以及這種差別與鼻咽癌的侵襲有何關系，本文采用RT-PCR、Western blot和免疫組織化學技術對鼻咽癌細胞株 CNE1、CNE2、HNE1、HNE2 和 SUNE1 及CNE2、HNE1裸鼠成瘤瘤塊中MMP9基因的表達進行了檢測，結果報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料

鼻咽癌細胞株：CNE1、CNE2、HNE2 均購自中山大學北校區實驗動物中心細胞庫，HNE1購自中南大學湘雅醫學院細胞庫，SUNE1購自南方醫科大學腫瘤研究所。

Trizol購自Invitrogen公司，Taq酶及逆轉錄試劑盒（ K1621）購自Fermentas公司。濃縮型MMP9鼠抗人單克隆抗體購自Abcam公司。SABC試劑盒、羊抗鼠IgG及DAB顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。HRP標記羊抗鼠IgG購自KPL公司。蛋白裂解液購自PIERCE公司。免疫印跡（Western Blot）試劑盒 ECL購自Amersham公司。硝酸纖維素膜及低分子量蛋白質標志物購自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人鼻咽癌細胞培養于10%新生牛血清的RPMI1640培養液中，37℃、5%二氧化碳培養至細胞長滿培養瓶底部70%～80%時，用含0.02%EDTA的胰蛋白酶消化傳代，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2 鼻咽癌細胞株中的MMP9蛋白表達的檢測培養瓶內放入蓋玻片，待細胞爬片融合到95%～100%時，以4%多聚甲醛固定20～30 min，采用SABC法進行細胞免疫組織化學染色，一抗為濃縮型MMP9鼠抗人單克隆抗體，1∶100稀釋，具體染色步驟參照說明書進行。用PBS代替一抗作陰性對照。細胞漿出現棕黃色顆粒為陽性染色。

取對數生長期CNE1、CNE2、HNE1、HNE2、SUNE1細胞，1×107個/mL （約50 mL培養瓶），蛋白提?。河妙A冷的PBS洗細胞3次，加入細胞裂解液400μL裂解細胞，冰盒上刮下細胞，4℃、10000 r/min離心10 min，收集上清，-20℃保存。Bradford比色法測定蛋白濃度定量，調節蛋白濃度一致后，行SDS-PAGE電泳。轉移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉37℃封閉1h，與鼠抗人MMP9一抗（1∶500稀釋）4℃孵育過夜，用TBST洗滌3次，每次15 min，然后加入HRP標記羊抗鼠IgG（1∶5000稀釋），37℃孵育1 h后，用增強型化學發光法檢測蛋白質表達，膠片掃描保存。

1.2.3 鼻咽癌細胞株中的MMP9 mRNA表達的檢測 收獲對數生長期的鼻咽癌細胞，用Trizol試劑從細胞中提取總RNA，逆轉錄成cDNA。全部引物采用Primer3軟件設計，由上海生工生物工程公司合成。引物序列和產物大小見表1?；驍U增反應體系為：2.5μL的 10×PCR 緩沖液，2μL cDNA，1μL dNTPs（2.5 mmol/L），上下游引物各 0.5μL（10 pmol/L），Taq 聚合酶 0.25μL（5U/μL），用 RNase Free dH2O加至25μL。PCR循環參數為：94℃預變性 4 min；然后 94℃變性 30 s，61℃（MMP9）/55℃（β-actin）復性 30 s，72℃延伸 30 s，30 個循環；最后72℃延伸5 min終止反應。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外燈觀察并照相。

1.2.4 HNE1和CNE2細胞裸鼠成瘤瘤塊組織中MMP9的表達 5～7周齡 BALB/c nu裸小鼠 10只，在SPF環境（中山大學實驗動物中心動物實驗部）中飼養，將對數生長期的人鼻咽癌HNE1和CNE2細胞分別以10×107個/mL及5×107個/mL的密度接種于裸鼠腋后背部皮下，每組5只，每只接種劑量0.2 mL。待瘤塊長至直徑10 mm左右后處死裸鼠，迅速解剖剝離腫瘤，以4%多聚甲醛液固定24 h，梯度酒精脫水、透明，石蠟包埋連續切片，SABC法檢測組織中MMP9的表達。

2 結果

2.1 5株鼻咽癌細胞MMP9免疫組化檢測結果

HNE1和SUNE1細胞中MMP9蛋白呈陽性表達，CNE1、CNE2及HNE2中未見到細胞MMP9蛋白的表達。結果見圖1。

2.2 鼻咽癌細胞系中MMP9 mRNA的表達

以β-actin為內對照，應用RT-PCR方法檢測了鼻咽癌細胞系CNE1、CNE2、HNE1、HNE2 及SUNE1中MMP9 mRNA的表達。結果如圖2所示，5株鼻咽癌細胞均有MMP9 mRNA表達，以HNE1和SUNE1表達較強，后者與免疫組織化學檢測結果一致。

2.3 鼻咽癌細胞系中MMP9蛋白的表達

表1 PCR引物序列和產物大小

圖1 MMP9在 CNE1、CNE2、HNE1、HNE2和SUNE1細胞中的表達情況（×200）

圖2 RT-PCR法檢測鼻咽癌細胞系MMP9 mRNA表達水平

圖3 Western Blot檢測鼻咽癌細胞系MMP9蛋白表達

圖4 MMP9在CNE2及HNE1細胞裸鼠成瘤瘤塊中的免疫組化陽性染色（×400）

Western Blot檢測結果如圖3所示。HNE1和SUNE1細胞中MMP9蛋白高表達，分別在92KD和83KD處檢測到酶原及酶的條帶。CNE1、CNE2及HNE2細胞中無明顯MMP9蛋白表達。

2.4 鼻咽癌細胞株裸鼠成瘤瘤塊MMP 9的免疫組化結果

HNE 1及CNE 2細胞各5只裸鼠種瘤均成功，瘤塊組織中MMP 9均呈強陽性表達。結果見圖4。

3 討論

鼻咽癌是我國常見的一種惡性腫瘤，臨床上易早期發生組織侵襲和淋巴結轉移，探討鼻咽癌浸潤和轉移機制具有非常重要的臨床和理論意義。

腫瘤細胞降解基底膜和侵入下層的結締組織是上皮性惡性腫瘤局部浸潤和遠處轉移的關鍵步驟，而MMP在此過程中起重要作用。MMP是一組具有許多共同生化性質的可降解細胞外基質的酶類，其活性異常與腫瘤侵襲能力和轉移發生密切相關，惡性腫瘤細胞陽性表達者其侵襲周圍組織能力明顯增強，且更易發生淋巴結和血道轉移，預后明顯較差。在MMP家族成員中，MMP 9主要降解Ⅳ型膠原。其中，Ⅳ型膠原是構成B M的主要支架和成分，腫瘤細胞的浸潤和轉移首先須發生B M的降解，即Ⅳ型膠原破壞就意味著腫瘤細胞的浸潤或即將發生浸潤。已有研究發現，MMP 9在多種惡性腫瘤中具有高表達，與腫瘤侵襲轉移密切相關[7，8]。

國內外學者研究認為，MMP 9有促進鼻咽癌細胞侵襲轉移的能力，可引起頸部淋巴結轉移[3～6]。近來已有學者發現，MMP 9與鼻咽癌顱內侵犯密切相關[9]。

然而，MMP 9在鼻咽癌細胞系中表達尚無文獻報道。本文采用細胞免疫組化、Western Blot和RT-PCR方法，檢測了MMP 9在鼻咽癌細胞系中MMP 9的表達。結果顯示，在鼻咽癌細胞系中，有HNE1及SUNE1多株細胞MMP 9較強表達。

通過不同的鼻咽癌細胞HNE1和CNE2裸鼠成瘤研究我們還發現，HNE1細胞在體內外MMP 9蛋白表達均較強。CNE2細胞MMP 9蛋白表達陰性，而該細胞裸鼠成瘤后表達強陽性，推測與體內外環境改變有關。通常在科研工作中，選擇各種細胞進行蛋白質水平的實驗是很常見的工作。但研究發現，細胞表型受到周圍微環境，特別是周圍細胞的細胞相互作用的影響，培養細胞可能因微環境改變或失去周圍細胞的相互作用而使基因表型發生改變。在細胞水平獲得的結果并不能完全代表體內的情況，所以在細胞水平取得的結果，如果能在組織中獲得進一步的驗證，其結果將更為可靠。本文通過MMP9蛋白表達較強的HNE1細胞和MMP9蛋白表達陰性的CNE2細胞裸鼠體內成瘤瘤塊免疫組化方法發現，兩者均有MMP9的強表達，進一步說明MMP9在鼻咽癌細胞系中的表達，可能在鼻咽癌浸潤轉移中起著重要的作用。

綜上，本文初步研究得出MMP9在鼻咽癌細胞系中具有高表達，其可能參與鼻咽癌的侵襲轉移等惡性生物學行為。通過探討鼻咽癌細胞系MMP9的表達及其改變與鼻咽癌成瘤性侵襲轉移等生物學行為的關系研究，為今后研究鼻咽癌的發生及侵襲轉移等機制并進行干預打下基礎。

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