PPAR-γ及CTGF對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及相互作用的研究

蔡 瑋，張 芳，劉 偉，楊?lèi)?ài)軍，王晨昱，李 敏

（蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理研究所，甘肅 蘭州 730030）

過(guò)氧化物酶增殖激活受體-γ（peroxisome proliferators activated receptors，PPAR-γ） 是一類(lèi)核轉(zhuǎn)錄因子[1]，可以調(diào)控腫瘤細(xì)胞分化，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF/）也與腫瘤細(xì)胞的增殖、血管的發(fā)生等方面相關(guān)[2]。有研究顯示[3]，轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子 -β（transeription growth factor β，TGF-β）是 CTGF上游的調(diào)控分子，在腫瘤細(xì)胞中，PPAR-γ與TGF-β的表達(dá)也相關(guān)[4]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察了PPAR-γ及CTGF對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的影響及兩者之間的關(guān)系。

1 實(shí)驗(yàn)材料

兔抗人多克隆PPAR-γ抗體及兔抗人多克隆CTGF抗體（武漢博士德生物工程有限公司）。鼠抗人單克隆CTGF抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）。SP免疫組化染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。人肝癌細(xì)胞株HepG-2由蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理研究所提供。甲氮甲唑藍(lán)（美國(guó)Sigma公司）。鼠尾膠（本實(shí)驗(yàn)室自制）。PPAR-γ激動(dòng)劑-羅格列酮（rosgilitazone，RGZ）（浙江萬(wàn)馬公司），完全溶于二甲亞砜，DMSO終濃度不超過(guò)0.1%。博依登小室（美國(guó)Millipore公司）。

1.1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1.1 免疫組化檢測(cè)HepG-2細(xì)胞中PPAR-γ及CTGF的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG-2細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液后爬片。免疫組織化學(xué)染色按試劑盒說(shuō)明操作。制片后光鏡下觀察細(xì)胞，細(xì)胞漿或細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。

1.1.2 PPAR-γ對(duì)HepG-2增殖作用的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG-2細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整密度為3×104/mL，懸浮于10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液中，接種于96孔板，每孔200μL。待細(xì)胞帖壁后，吸去原培養(yǎng)基，加入終濃度分別為5、10、20、40和80μmol/L的RGZ，終體積為200μL。每個(gè)濃度級(jí)設(shè)4個(gè)復(fù)孔，每次設(shè)對(duì)照組（僅含二甲亞砜的RPMI 1640培養(yǎng)基）。加藥后分別培養(yǎng)12、24、48和72 h，每孔加 MTT溶液 20μL，繼續(xù)孵育 4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄上清，加二甲基亞砜150μL，振蕩10 min，酶標(biāo)儀測(cè)570 nm波長(zhǎng)A值。重復(fù)3次試驗(yàn)，取均值。按以下公式計(jì)算，抑制率（inhibition rate，IR%）=（1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值）×100%。增殖率（growth rate，GR%）=（實(shí)驗(yàn)組 A值 /對(duì)照組 A值）×100%。

1.1.3 CTGF對(duì)HepG-2增殖作用的影響 細(xì)胞處理及加樣方法同1.1.2。加入終濃度分別為5、10、20和50μg/mL的CTGF抗體，分別培養(yǎng)24、48、72 h，MTT檢測(cè)方法及抑制率、增殖率計(jì)算公式同1.1.2。

1.1.4 PPAR-γ及CTGF對(duì)HepG-2侵襲性的影響 博依登小室下室加入含40%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，終體積為200μL。將3g/L的自制鼠尾膠按40μL/孔均勻地鋪在博依登小室上下室之間的孔徑為8μm的濾膜的上室面上，置37℃30 min聚合成凝膠。上室加入密度為1.0×106個(gè)/mL的HepG-2單細(xì)胞懸液（細(xì)胞預(yù)先在不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h），上室終體積為300μL。將小室置于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)48 h后用棉簽頭擦掉自制鼠尾膠，PBS洗3次，95%乙醇固定。對(duì)己穿透的細(xì)胞進(jìn)行蘇木素染色，相差顯微鏡觀察、拍照并計(jì)數(shù)。每個(gè)濾膜分別計(jì)數(shù)隨機(jī)5個(gè)視野內(nèi)的穿膜細(xì)胞數(shù)后計(jì)算平均值。每組設(shè)3個(gè)平行小室，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

試驗(yàn)分為3組；A組：細(xì)胞不加處理組。B組：上室細(xì)胞預(yù)先用RGZ處理48h，濃度為40μmol/L。C組：上室細(xì)胞預(yù)先用CTGF抗體封閉處理48h，抗體濃度為10μg/mL。

1.1.5 PPAR-γ及CTGF對(duì)HepG-2細(xì)胞系遷移性的影響 方法兩點(diǎn)不同：膜的上室面不鋪膠；上室細(xì)胞濃度為6.0×105個(gè)/mL，分組同侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.1.6 RT-PCR測(cè)定經(jīng)PPAR-γ激動(dòng)劑處理后CTGF的表達(dá) 設(shè)計(jì)引物序列如下：CTGF的上游引物5'-GCAGGCTAGAGAAGCAGAGC-3'，下游引物 5'-ATGTCTTCATGCTGGTGCAG-3'，產(chǎn)物大小為105 bp；內(nèi)參β-actin的上游引物5'-TGGAGAAGAGCTATGAGCTGCCTG-3'，下游引物 5'-GTGCCA CCAGACAGCACTGTGTTG-3'，產(chǎn)物大小為202 bp。Marker由大連寶生物提供，序列號(hào)為D513A。RT-PCR引物設(shè)計(jì)參照有關(guān)文獻(xiàn)，經(jīng)基因庫(kù)核實(shí)，由上海生物工程公司合成。細(xì)胞預(yù)先經(jīng)RGZ處理（濃度為40μmol/L，處理48h），按Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞中的總RNA，反應(yīng)條件為50℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，94℃預(yù)變性 5 min，94℃變性 30 s，54℃退火 1 min，72℃延伸1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min，瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)中拍照記錄、分析結(jié)果。

1.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 免疫組化檢測(cè)HepG-2中PPAR-γ及CTGF的表達(dá)

圖1 HepG-2細(xì)胞中PPAR-γ的表達(dá)（×200）

圖2 HepG-2細(xì)胞中CTGF的表達(dá)（×200）

2.2 RGZ對(duì)HepG-2作用的時(shí)間及劑量依賴(lài)性

RGZ對(duì)HepG-2細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性。與對(duì)照組相比，20～80μmol/L的RGZ可以抑制HepG-2細(xì)胞的生長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），而 5μmol/L、10μmol/L的RGZ對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用與對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），見(jiàn)圖 3。

圖3 RGZ對(duì)HepG-2作用曲線

2.3 CTGF抗體對(duì)HepG-2作用的時(shí)間及劑量依賴(lài)性

表1 不同濃度CTGF抗體處理后細(xì)胞抑制率差異（）

表1 不同濃度CTGF抗體處理后細(xì)胞抑制率差異（）

注：1）與對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與對(duì)照組比較，P＜0.01

抗體濃度（μg/mL）IR（%）24h 48h 72h對(duì)照組 0 0 053.57±0.48 6.12±0.35 2.73±1.8710 13.66±1.072） 16.93±1.382） 11.22±1.85205016.5±0.322）28.02±1.642）20.75±1.792）31.00±1.272）15.37±1.511）27.06±1.242）

經(jīng)CTGF抗體處理后，HepG-2細(xì)胞增殖有明顯的抑制，抗體劑量越大，抑制率越明顯。同一抗體濃度時(shí)，48 h抑制率達(dá)到最大值。細(xì)胞增殖的抑制呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性。10～50μg/mL的CTGF抗體處理后，HepG-2細(xì)胞的生長(zhǎng)與對(duì)照組相比明顯受抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而5μg/mL組與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

2.4 PPAR-γ及CTGF對(duì)HepG-2侵襲及遷移能力的影響

可以看出，與RGZ處理前（圖4A）相比，處理后（圖4B）侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)目明顯減少（圖中深染的為蘇木素著色的細(xì)胞核）。

侵襲實(shí)驗(yàn)：加入RGZ和CTGF抗體封閉處理后，與對(duì)照組相比，侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)目減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表 2。

遷移試驗(yàn)：與對(duì)照組相比，PPAR-γ激動(dòng)劑及CTGF抗體處理之后，遷移穿膜細(xì)胞數(shù)目都有所減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PPAR-γ處理組穿膜細(xì)胞數(shù)變化較CTGF處理組明顯，變化趨勢(shì)基本與侵襲試驗(yàn)一致，見(jiàn)表2。

圖4 RGZ處理前后侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)目的變化（蘇木素染色×100）

表2 RGZ及CTGF抗體處理后HepG-2細(xì)胞侵襲及遷移能力的改變（）

表2 RGZ及CTGF抗體處理后HepG-2細(xì)胞侵襲及遷移能力的改變（）

注：?與A組比較，P＜0.05

組別 A組 B組 C組侵襲實(shí)驗(yàn)組 67.78±2.13 54.11±3.12? 56.82±4.25?遷移實(shí)驗(yàn)組 89.32±3.57 75.89±5.24? 80.55±3.69?

圖5 RGZ處理前、后CTGF的表達(dá)

2.5 經(jīng)RGZ處理前、后CTGF的表達(dá)

表3 RGZ處理前、后CTGF mRNA的表達(dá)（）

表3 RGZ處理前、后CTGF mRNA的表達(dá)（）

組別 CTGF mRNA未處理組 0.7841±0.0403處理組 0.5783±0.0332

HepG-2細(xì)胞中，CTGF有表達(dá)，經(jīng)RGZ處理后CTGF的表達(dá)相對(duì)于未處理組降低，見(jiàn)圖5，表3。

3 討論

PPAR是核激素受體超家族的成員，它是由英國(guó)科學(xué)家ISSEMANN和GREEN[5]于1990年首先發(fā)現(xiàn)的。該受體有3種亞型：PPAR-α、PPAR-γ和PPAR-β-δ，這3種亞型在結(jié)構(gòu)及功能上均有差異[6]。PPAR-γ與配體結(jié)合后被激活，其配體包括天然配體和合成配體兩類(lèi)。天然配體主要有：必需脂肪酸及其代謝產(chǎn)物，如亞麻酸、亞油酸、花生四烯酸等。人工合成激動(dòng)劑，如噻唑烷二酮類(lèi)也就是格列酮類(lèi)藥物，包括吡格列酮、羅格列酮、曲格列酮、環(huán)格列酮等。

起初對(duì)于PPAR-γ的研究主要集中在糖尿病方面，近年來(lái)對(duì)PPAR在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的影響作用的研究也日漸增多，尤其是γ亞型，與腫瘤關(guān)系最為密切。研究發(fā)現(xiàn)，PPAR-γ位于機(jī)體多種信號(hào)傳導(dǎo)的交叉點(diǎn)，其被配體激活后可通過(guò)抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，有望成為腫瘤化療的一個(gè)新途徑。研究還表明，PPAR-γ活化后抗癌機(jī)制主要通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期[7]、誘導(dǎo)凋亡[3]、抑制COX-2表達(dá)[8]等途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)。

本文的研究證實(shí)，加入PPAR-γ的激動(dòng)劑后，HepG-2細(xì)胞的生長(zhǎng)受到不同程度的抑制，呈劑量及時(shí)間依賴(lài)關(guān)系，且在48 h內(nèi)，抑制率的改變最具意義，與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道一致[9]。進(jìn)一步通過(guò)博依登小室的侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PPAR-γ對(duì)細(xì)胞侵襲和遷移也同樣發(fā)揮調(diào)控作用，加入PPAR-γ激動(dòng)劑后，肝癌細(xì)胞侵襲和遷移能力受到抑制，說(shuō)明PPAR-γ在肝癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著一定的作用，抑制了肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移。

CTGF是 CCN家族成員之一，1991年由RADHAM等[10]首先在人類(lèi)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)了人類(lèi)的CTGF（hCTGF）。目前所發(fā)現(xiàn)的 CCN家族包括 Cry61，CTGF，Nov，W ISP-1，W ISP-2和W ISP-3六個(gè)成員。在發(fā)現(xiàn)伊始，對(duì)于CTGF的研究主要集中在纖維化方面，各種研究證實(shí)，CTGF是纖維化形成過(guò)程中的重要介質(zhì)[4]。

近年來(lái)，CTGF與腫瘤的關(guān)系也逐漸受到重視。研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌、軟骨肉瘤中CTGF的表達(dá)升高[11]，在約61%的急性淋巴細(xì)胞白血病患者的骨髓中也出現(xiàn)CTGF的過(guò)度表達(dá)[12]。CCN是一組功能復(fù)雜的基因，它們不僅參與正常機(jī)體的生長(zhǎng)調(diào)控，而且與腫瘤有密切聯(lián)系，在腫瘤生長(zhǎng)、血管生成、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過(guò)程中起重要作用，且功能復(fù)雜多樣。CTGF在腫瘤中的具體作用，目前還不是很清楚。

本文在對(duì)CTGF的研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，加入CTGF的抗體封閉之后，HepG-2細(xì)胞的增殖受到抑制，也呈劑量及時(shí)間依賴(lài)關(guān)系，且肝癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力也有所下降。CHANG等的研究也有相似的結(jié)果[13]。

RT-PCR檢測(cè)經(jīng) RGZ事先處理（40μmol/L、48h）及未處理組的CTGF的表達(dá)的改變發(fā)現(xiàn)，處理組CTGF的表達(dá)相對(duì)于未處理組下降，提示PPAR-γ參與調(diào)控HepG-2的生長(zhǎng)，部分是通過(guò)改變CTGF的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在肝臟組織中，不僅在纖維化的過(guò)程中PPAR-γ-CTGF途徑發(fā)揮重要的作用，在肝癌的發(fā)展過(guò)程中，PPARγ-CTGF通路同樣存在并且發(fā)揮調(diào)控作用。

PPAR-γ及CTGF都是近幾年才被發(fā)現(xiàn)與癌癥的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的因子，對(duì)于其具體的調(diào)控機(jī)制及作用通路研究并不十分明確，而發(fā)現(xiàn)PPAR-γ-CTGF途徑，無(wú)疑為相關(guān)的研究和臨床治療提供了一個(gè)新的方向。

[1]H.PHILLIP KOEFFLER.Peroxisome proliferator-activated receptorγ and cancers[J].Clinical Cancer Research,2003,(9):1-9.

[2]S.MUEHLICH,B.KRUEGER,C.D.GARLICHS,et al.CCN abstracts[J].Clinical Pathology,2005,(58):466-478.

[3]BETH COYLE,CAROLINE FREATHY,TIMOTHY W.GANT,et al.Characterization of the transforming growth factor-B1-induced apoptotic transcriptome in FaO hepatoma cells[J].JBC Papers in Press,2002,(10):1074-1077.

[4]VIKTOR TODOROVIC,CHIH-CHIUN CHEN,NISSIM HAY,et al.The matrix protein CCN1 (CYR61)induces apoptosis in fibroblasts[J].JCB,2005,171(3):559-568.

[5]SIGAL GERY,DONG XIE,DONG YIN,etal.Ovarian carcinomas:CCN genes are aberrantly expressed and CCN1 promotes proliferation of these cells[J].Clinical Cancer Research,2005,(11):7243-7254.

[6]JIANG LQ,ZHUANG YZ,CAO JG,etal.Rosiglitazone enhanced growth inhibition of transplanted lung adenocarcinoma by Cisplatin in nude mice [J].China Journal of Modern Medicine,2008,18(9):1226-1229.Chinese

[7]MOUNIA ALAOUI-EL-AZHER,YONGZHENG WU,NATHALIE HAVET,et al.Arachidonic acid differentially affects basal and lipopolysaccharide-induced sPLA2-IIA expression in alveolar macrophages through NF-B and PPAR-γ dependent pathways[J].Mol Pharmacol,2002,(61):786-794.

[8]GUIDO EIBL,YASUNORI TAKATA,LASZLO G.BOROS,et al.Growth stimulation of COX-2-negative pancreatic cancer by a selective COX-2 inhibitor[J].Cancer Research,2005,(65):982-990.

[9]KOJIRO MATSUMOTO,SONGTAO YU,YUZHI JIA,et al.Critical role for transcription coactivator peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-binding protein/TRAP220 in liver regeneration and PPAR ligand-induced liver tumor development[J].J.Biol.Chem.,2007,282(23):17053-17060.

[10]SEIJI KONDO,NORIKO TANAKA,SATOSHI KUBOTA,et al.Novel angiogenic inhibitor DN-9693 that inhibits post-transcriptional induction of connective tissue growth factor (CTGF/CCN2)by vascular endothelial growth factor in human endothelial cells[J].Mol Cancer Ther,2006,(5):129-137.

[11]WENGER C,ELLENRIEDERV,ALBERB,et al.Expression and differential regulation of connective tissue growth factor in pancreatic cancer cells[J].Oncogene,1999,18(4):1073-1080.

[12]VORWERK P,WEX H,HOHMANN B,et al.CTGF(IGFBP2rP2)is specifically exp ressed in malignant lymphoblasts of patients with acute lymphoblastic leukaemia (ALL)[J].Br J Cancer,2000,83(6):756-760.

[13]CHENG-CHI CHANG,JIN-YUAN SHIH,YUNG-MING JENG,et al.Connective tissue growth factor and its role in lung adenocarcinoma invasion and metastasis [J].Journal of the National Cancer Institute,2004,96(5):364-375.