己酮可可堿對染汞大鼠脊髓及背根神經節TNF-α表達的影響*

張 軍，周永田，徐旭東，謝 林，李 娟，徐明怡

（1.山東省醫藥工業設計院，山東 濟南 250013；2.山東省職業衛生和職業醫學院，山東 濟南 250002）

近年的研究顯示，許多汞中毒患者出現的長期、劇烈、自發性肌肉刺痛或燒灼痛，以下肢為主，常伴有患肢麻木和痛覺過敏，肌電圖顯示神經傳導速度減慢[1，2]。目前臨床治療汞中毒主要應用螯合劑驅汞，輔以對癥治療，對汞中毒疼痛缺乏有效治療措施。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），由激活的單核-巨噬細胞分泌，主要合成部位在背根神經節（DRG）的大、中型細胞[3]。TNF-α廣泛分布于中樞、周圍神經系統，具有多種生理功能。研究表明，TNF-α與神經病理性疼痛的產生及其持續狀態有密切關系[4]。為探討汞中毒疼痛發病機制及有效治療方法，筆者觀察了氯化汞和己酮可可堿對大鼠脊髓和DRG中TNF-α的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

實驗用HgCl2（上海化學試劑總廠，生產批號為990402），二巰丙磺納注射液（DMPS，上海禾豐制藥有限公司，生產批號為0309011），己酮可可堿緩釋片（pentoxifylline，POF）（德國 Merckle GmbH 藥業公司產品，生產批號為C20571）；TNF-α檢測試劑盒（武漢博生微生物工程有限公司，生產編號為SA1025）。

1.2 動物

健康雄性清潔級SD大鼠40只，體重180～220 g，（上海希蒲爾必凱實驗動物有限公司），動物質量合格證號為SCXK（滬）2003-0002，本院動物房飼養，室內溫度19～24℃，相對濕度40%～70%，自由攝食飲水。

1.3 分組染汞

將動物隨機分為7組；對照組（10只）經口灌胃生理鹽水（NS）2 mL，1次 /d；A、B、C組（各 5只）按17 mg/kg（1/4LD50）；D、E、F 組（各 5 只）按 8.5 mg/kg（1/8LD50），經口灌胃HgCl2溶液，1次/d。7組均連續灌胃18～22 d。染毒組超過50%的動物出現中毒癥狀（動物出現步態不穩，行動障礙或痙攣）[5]后停止染汞。疼痛判斷標準：動物出現抓舔肢體、甩尾、嘶叫、翻身、轉圈等表現[6]。

1.4 藥物干預

50%的動物出現中毒癥狀后，處死對照組5只大鼠和A、D組大鼠，剩余染汞大鼠作藥物干預實驗。B、E組大鼠用DMPS按28 mg/kg腹腔注射驅汞2個療程（每天1次，驅汞3 d，休息4 d為1個療程），C組大鼠用DMPS+POF（按29.22 mg/kg經口灌胃，每天1次，共14 d）；F組和對照組5只大鼠腹腔注射NS 1 mL/次，方法同DMPS。實驗結束后處死全部動物。

1.5 獲取標本

用1%戊巴比妥鈉按40 mg/kg腔腹注射麻醉動物，隨后將其固定于解剖臺上，剖胸做心臟穿刺，將針頭固定于升主動脈，先灌注NS約150 mL，再灌注4%多聚甲醛磷酸緩沖液（pH7.4）約200 mL，待動物僵硬后取出脊髓L5-6節段和兩側L5、L6背根神經節（DRG），置于10%的甲醛磷酸緩沖液中固定，按常規制成病理切片，片厚15μm。

1.6 檢測指標

用免疫組織化學鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶聚合物法[7]（SABC）測定DRG及脊髓TNF-α，嚴格按照試劑盒說明書要求操作。

1.7 圖像分析

用400倍光學顯微鏡觀察切片，并將圖像通過攝像頭轉入計算機圖像分析系統，用LEICA QWIN V3圖像分析軟件對病理切片進行分析。每個DRG取5張連續切片，隨機選取上、下、左、右、中5個互不重疊的視野；每個L5-6脊髓階段連續取5張切片，在脊髓背角Ⅰ層和Ⅱ層細胞取5個互不重疊的視野，計算免疫陽性物的平均灰度和平均面積。

1.8 統計學分析

用SPSS10.0軟件，采用Homogeneity-of-variance首先對資料進行方差齊性檢驗。若方差齊性，單因素方差分析（One-way ANOVA）并采用Dun-nett-test進行染毒組與對照組均數間兩兩比較；方差不齊時，用Kruskal-Wallis test非參數統計，用Mann-Whitney test進行均數間兩兩比較。以P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 動物染毒與中毒表現

A、B、C（17 mg/kg）組大鼠于染汞第 12 天時開始出現口腔流涎，口腔出現血性分泌物，精神萎靡，活動減少，步態僵硬、笨拙，皮毛粗糙，尿量增多，大便稀。染汞第19天有9只大鼠出現汞中毒表現，停止染汞。汞中毒大鼠中有1只于染汞第17天出現疼痛表現；該大鼠不停的舔、抓雙下肢、雙后腳和尾部，致使該部位出現紅腫，甚至部分皮膚破損，該大鼠并未受傷，故判斷為汞中毒疼痛。藥物干預實驗結束時該大鼠仍有疼痛表現。D、E、F（8.5 mg/kg）組大鼠于第16天開始出現口腔流涎，口腔有血性分泌物，活動減少，步態笨拙，精神倦怠，皮毛粗糙，尿量增多，大便稀。于第22天有8只大鼠出現汞中毒表現，停止染汞。無疼痛大鼠出現。對照組大鼠全部正常生存。

2.2 汞中毒大鼠脊髓TNF-α平均灰度與陽性反應物平均面積

表1可見，驅汞前各染汞組大鼠脊髓TNF-a平均灰度均顯著低于對照組，平均面積均顯著大于對照組（P＜0.05）；驅汞 14 d后，B、E、F組 TNF-a表達仍顯著強于對照組；C與B組相比，TNF-α灰度顯著提高，平均面積顯著減少（P＜0.05），已接近對照組水平。

2.3 汞中毒大鼠背根神經節TNF-α平均灰度與陽性反應物平均面積

表2可見，驅汞前各染汞組大鼠背根神經節TNF-α平均灰度均顯著低于對照組，平均面積均顯著大于對照組（P＜0.05）。驅汞 14 d后，B、E、F組TNF-α平均灰度有所升高，平均面積有所減小，但與對照組相比，仍有顯著差異。C組與B組相比，TNF-α平均灰度顯著升高，平均面積顯著減少（P＜0.05），已接近對照組水平。

表1 汞中毒大鼠脊髓TNF-α平均灰度與陽性反應物平均面積 （n=5，）

表1 汞中毒大鼠脊髓TNF-α平均灰度與陽性反應物平均面積 （n=5，）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與B組相比，P＜0.05

組別 驅汞前驅汞后平均灰度 平均面積 平均灰度 平均面積對照組 212.93±21.03 3211.56±48.29 267.19±23.57 2917.58±55.81 A組（高Hg） 113.75±4.211） 4937.13±77.031） - -B組（高 Hg+DMPS） 92.56±3.821） 4855.01±82.691） 115.33±18.321） 4407.12±31.451）C組（高Hg+DMPS+己） 99.02±8.211） 5014.05±57.621） 177.63±12.792） 2991.32±29.712）D組（低Hg） 137.53±5.371） 4671.55±77.351） - -E 組（低 Hg+DMPS） 122.65±5.291） 4408.93±47.051） 152.71±11.061） 3851.07±25.991）F 組（低 Hg+NS） 135.66±4.371） 4502.31±54.081） 142.69±11.871） 3908.16±72.191）

表2 汞中毒大鼠背根神經節TNF-α平均灰度與陽性反應物平均面積 （n=20，）

表2 汞中毒大鼠背根神經節TNF-α平均灰度與陽性反應物平均面積 （n=20，）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與B組相比，P＜0.05

驅汞后平均灰度 平均面積 平均灰度 平均面積對照組 237.19±7.64 3418.35±67.22 261.27±8.83 3710.47±25.59 A組（高Hg） 116.96±7.261） 5920.48±28.191） - -B組（高 Hg+DMPS） 105.62±7.291） 5671.95±38.271） 131.43±5.771） 4992.73±62.191）C組（高Hg+DMPS+己） 113.28±7.281） 5723.91±62.191） 241.69±7.182） 4012.16±26.972）D組（低Hg） 106.55±4.981） 5594.24±49.381） - -E 組（低 Hg+DMPS） 116.27±7.331） 5829.84±56.381） 144.36±14.311） 4211.06±38.951）F 組（低 Hg+NS） 120.03±6.221） 5891.05±52.181） 142.52±12.071） 3990.35±51.071）組別 驅汞前

3 討論

本實驗結果表明，亞急性汞中毒大鼠脊髓后角和背根神經節TNF-α表達水平顯著高于對照組，而且用DMPS驅汞14 d后仍未見TNF-α表達顯著減弱，說明單純用DMPS驅汞并不能抑制TNF-α 表達。17 mg/kg染汞（B、C）組和 8.5 mg/kg染汞（E、F）組之間TNF-α平均灰度和平均面積差異均無統計學意義，未見到劑量-效應關系，這可能與兩染汞組之間劑量相距較近有關。

TNF-α是一種前炎性細胞因子，有多種生物學效應，與神經病理性疼痛的產生和持續存在有密切關系。研究發現，TNF-α不僅有單核-巨噬細胞產生，而且也可以由神經細胞和膠質細胞產生[8]。當機體處于受傷、感染、免疫功能異常等多種病理狀態時，中樞的膠質細胞就會被激活，釋放出IL-1、IL-6、TNF-α及NGF等多種細胞因子以及興奮性氨基酸、NO等神經遞質，它們一方面作用于痛覺神經元，使其興奮性增強，向高級中樞傳遞疼痛信號，另一方面降低神經元的興奮閾值，造成中樞敏化，使許多無效閾下神經沖動變為有效閾上神經刺激，使疼痛信號傳遞的頻率和幅度大為提高。同時，這些細胞因子還可以作用于膠質細胞，產生正反饋作用，進一步增加細胞因子的數量，形成瀑布效應，從而形成了神經病理性疼痛的持續狀態[9]。

己酮可可堿是黃嘌呤代謝產物，有擴張腦和周圍血管的作用，可以改善腦和四肢的血液循環。近期研究發現，它還有抑制中樞膠質細胞激活和抑制TNF-α產生的作用[10]。本文的實驗結果與他們的結論一致，說明己酮可可堿有可能在汞中毒疼痛的治療中，發揮積極作用。

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