赭曲霉對16α,17α-環氧黃體酮的C11α-羥基化工藝研究

16α,17α-環氧黃體酮(16α,17α-Epoxyprogesterone，EP)全稱為16α,17α-環氧孕甾-4-烯-3,20-二酮，又名沃式氧化物，白色結晶粉末，無臭，微溶于乙醇、甲醇、甲苯。利用微生物進行C11α-羥基化是甾體生物轉化中的一個重要反應[1]，得到的C11α-羥基化產物是合成地塞米松、強的松龍等藥物的重要中間體。據文獻報道，應用于16α,17α-環氧黃體酮C11α-羥基化的微生物生產菌種主要有黑根霉(Rhizopusnigricans)[2～4]、雅致小克銀漢霉(Cunninghamellaelegans)[5]和綠僵菌(Metarhiziumsp.)[6]等，產率一般在45%～75%之間，對發酵條件及操作要求較高且副產物種類較多。

作者就赭曲霉(Aspergillusochraceus)405轉化16α,17α-環氧黃體酮的C11α-羥基化工藝進行了研究，并將羥丙基-β-環糊精(HP-β-CD)應用于該反應中，提高了轉化率。

1 實驗

1.1 試劑和儀器

16α,17α-環氧黃體酮，天津津津藥業有限公司；其它試劑均為市售分析純。

Agilent1100型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；HP-β-CD(取代度6.52)，西安德立生物化工有限公司。

1.2 菌種和培養基

菌種：赭曲霉(Aspergillusochraceus)405，天津科技大學微生物制藥研究室保藏。

斜面培養基(g·L-1)：土豆200，葡萄糖20，瓊脂20，酵母膏1，pH值自然。

轉化培養基(g·L-1)：葡萄糖30，玉米漿40，蠶蛹粉2，硫酸銨1.5，pH值6.4。

1.3 16α,17α-環氧黃體酮的C11α-羥基化反應

將斜面菌種于28℃ 培養7 d，無菌水洗下孢子，制成濃度為5×107個·mL-1的孢子溶液，取一定量接種于50 mL/250 mL三角瓶發酵培養基中，28℃、200 r·min-1振蕩培養28 h，加入10 g·L-1EP，繼續轉化48 h。

1.4 HP-β-CD的添加方式

稱取與EP不同摩爾比的HP-β-CD，用紫外線滅菌30 min后分別加入到發酵液中。

1.5 相溶解度的測定

配制一系列濃度的 HP-β-CD 溶液，各取10 mL于具塞試管，加過量的EP，在搖床上28℃、200 r·min-1恒溫振蕩24 h。取上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾，用高效液相色譜法測定其濃度，以EP濃度為縱坐標、HP-β-CD濃度為橫坐標，繪制相溶解度圖。

1.6 轉化率測定

取2 mL發酵液加入4 mL乙酸乙酯進行萃取，離心，精確取上清液0.1 mL于1.5 mL的小離心管中，自然風干后加1 mL流動相，12 000 r·min-1離心10 min。然后用高效液相色譜儀檢測，色譜柱為Phenomenex C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流動相為甲醇∶水=80∶20(體積比)；流速1 mL·min-1；檢測波長240 nm；柱溫30℃；進樣量20 μL；外標法檢測。轉化率依下式計算：

式中：X為液相測得的產物濃度，mg·L-1；d為稀釋倍數；V為發酵液的體積,L；mEP為V體積內底物的質量,mg；MEP與M產物分別為底物與產物的摩爾質量，g·mol-1。

2 結果與討論

2.1 搖床轉速對轉化率的影響

搖床轉速對轉化體系的影響主要包括溶氧和剪切力兩方面，提高轉速可以強化底物和氧氣在菌體發酵體系中的傳質，促進酶與底物的充分接觸。但隨著搖床轉速的提高，剪切力也相應增大，會將菌絲打碎，反而不利于細胞的生長。考察搖床轉速對轉化率的影響,結果見圖1。

圖1 搖床轉速對轉化率的影響

由圖1可知，當轉速為200 r·min-1時，赭曲霉菌球大小一致，轉化率最高，最適宜轉化反應的進行。

2.2 接種量對C11α-羥基化反應的影響

配制濃度為5×107個·mL-1的赭曲霉孢子懸浮液，以不同接種量接種，考察接種量對C11α-羥基化反應的影響，結果見表1。

由表1可知，接種量較小，菌球大而數量少；隨接種量增大，搖瓶內菌球變小、數量增加，發酵液逐漸呈粥狀。轉化率也隨著接種量和搖瓶中菌球形態的不同而不同，接種量為2.0%時轉化率最高達72.6%，此時，搖瓶中菌球呈小米狀。

表1 接種量對EP C11α-羥基化反應的影響

2.3 底物投料方式對轉化率的影響

考察了不同底物投料方式對轉化率的影響，結果見圖2。(1)有機溶劑助溶法：分別用甲醇、乙醇、丙酮、丙二醇、DMF、DMSO溶解EP，所有溶劑均按照4%的比例添加，然后超聲振蕩處理5 min以加速EP在溶劑中的分散，加入到已培養好的菌體中進行轉化實驗。(2)吐溫80乳化法：用吐溫80溶液高溫乳化EP后，超聲振蕩5 min，然后加入到已培養好的菌體中進行轉化實驗。(3)干粉投料法：將EP紫外滅菌后直接加入到已培養好的菌體中進行轉化實驗。

圖2 底物投料方式對轉化率的影響

由圖2可知，用乙醇溶解EP后進行超聲振蕩處理的投料方式的轉化率最高，為74.2%。

2.4 轉化培養基初始pH值對轉化率的影響

赭曲霉轉化EP，是利用胞內酶的作用，而酶與底物的作用必須有合適的pH值。另外，培養基初始pH值影響跨膜pH值梯度，影響膜的通透性，進而影響菌體生長與產物的生成，是生物轉化的關鍵因素之一[4]。考察初始pH值對轉化率的影響，結果如圖3所示。

圖3 轉化培養基初始pH值對轉化率的影響

由圖3可知，轉化培養基初始pH值為5.0時，轉化率最高。

2.5 底物投加時間對轉化率的影響

羥化酶為誘導酶，底物的添加時間往往對轉化效果產生顯著影響。選取在快速生長期內的不同時期加入EP進行轉化實驗，考察底物投加時間對轉化率的影響，結果見圖4。

圖4 底物投加時間對轉化率的影響

由圖4可知，在28 h左右進行投料的轉化率最高，達80.3%。

2.6 底物濃度對轉化率的影響(圖5)

圖5 底物濃度對轉化率的影響

由圖5可知，轉化率隨底物濃度的增加而顯著降低，底物濃度較低時(10 g·L-1)的轉化率最高，達80.5%。

2.7 環糊精添加比例對轉化率的影響

環糊精能顯著增加EP等疏水化合物的水溶性，在一定范圍內其溶解度的增加與環糊精的添加量呈線性關系(圖6)。在轉化過程進行4 h時添加與EP不同摩爾比的HP-β-CD，28℃、200 r·min-1反應48 h,結果見圖7。

圖6 EP在HP-β-CD溶液中的相溶解圖

圖7 HP-β-CD與EP摩爾比對轉化率的影響

由圖7可知，加入與EP摩爾比為(0.25～1.25)∶1的HP-β-CD時，底物轉化率隨著HP-β-CD加量的增大而上升；n(HP-β-CD)∶n(EP)為1.25∶1時，轉化率最高，為93.1%，較未添加HP-β-CD的轉化率提高了12.6%;繼續增加HP-β-CD的量，轉化率轉而下降。

3 結論

確定了利用赭曲霉進行16α,17α-環氧黃體酮的C11α-羥基化的最佳轉化條件如下：轉化培養基初始pH值為5.0、接種量為2.0%、搖床轉速為200 r·min-1、培養28 h時投加用乙醇溶解的EP、EP濃度為10 g·L-1，此條件下轉化率達80.5%。在轉化反應進行4 h時添加與EP摩爾比為1.25∶1的HP-β-CD，轉化率達到93.1%，較未添加HP-β-CD的轉化率提高了12.6%。

參考文獻：

[1] Fernandes P，Cruz A，Angelova B，et al．Microbial conversion of steroid compounds：Recent developments[J]．Enzyme and Microbial Technology，2003，32(6)：688-705．

[2] 杜大慶，劉玲玲，張星元，等．黑根霉對甾體的C11α-羥基化反應[J]．河南工業大學學報(自然科學版)，2006，27(3):70-74.

[3] 萬金營，杜連祥，鞏培，等．雙液相體系下對黑根霉C11α-羥基化16α,17α-環氧孕酮的研究[J]．天津科技大學學報，2009，24(2):13-16．

[4] Roglic U， Znidarsic-Plazl P，Plazl I．The influence ofβ-cyclodextrin on the kinetics of progesterone transformation byRhizopusnigricans[J]．Biocatalysis and Biotransformation，2005，23(5)：299-305．

[5] 徐銀，陳小龍，鄭裕國．雅致小克銀漢霉對16α,17α-環氧黃體酮C11α-羥基化的工藝研究[J]．中國生化藥物雜志，2009，30(4):239-242．

[6] 李安華，王藝軍，王明道，等．綠僵菌羥基化16α,17α-環氧黃體酮的工藝研究[J]．河南科學，2007，25(5)：754-757．