超濾提取黃芪多糖的工藝研究

黃芪(Radixastragali)為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，補(bǔ)中益氣,含有多糖、甙類、氨基酸、黃酮和微量元素等多種化學(xué)成分[1]。近年來(lái)經(jīng)研究及臨床驗(yàn)證，分子量小于80 000的黃芪多糖可制成靜脈注射液，用于化療后的滋補(bǔ)，以提高人體的免疫力[2]，也可以對(duì)其改性而增強(qiáng)其活性，具有很好的抗艾滋病和抗凝血作用[3，4]；分子量大于80 000的黃芪多糖則可制成營(yíng)養(yǎng)口服液。

按不同分子量分離提取黃芪多糖是黃芪綜合利用的重要途徑,其中能否分離出均一的多糖非常重要。鑒于超濾技術(shù)[5]具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、節(jié)省能源、不產(chǎn)生二次污染等優(yōu)點(diǎn)，作者在此采用超濾技術(shù)對(duì)黃芪多糖進(jìn)行分離純化，考察了操作壓力、運(yùn)行溫度、流速、初始料液濃度等工藝參數(shù)對(duì)超濾提取的影響，擬為黃芪多糖在醫(yī)藥領(lǐng)域和保健品行業(yè)的工業(yè)化開發(fā)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 原料、試劑與儀器

黃芪多糖，甘肅效靈生物開發(fā)有限責(zé)任公司。

葡萄糖、乙醇、苯酚、硫酸，均為分析純。

UV-2401PC型紫外分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司分析儀器總廠；HH-601型恒溫水浴鍋，金壇恒豐儀器廠；DDS-307型電導(dǎo)率儀；Hanna濁度分析儀；高速管式離心機(jī)；平板式超濾膜設(shè)備：膜面積1 m2，截留分子量(或孔徑)0.2 μm、0.1 μm、20萬(wàn)、10萬(wàn)、5萬(wàn)、2萬(wàn)、1萬(wàn)、0.5萬(wàn)，廈門世達(dá)膜科技有限公司。

1.2 裝置(圖1)

1.料液箱 2.低壓泵 3.保安過(guò)濾器 4.高壓泵 5.膜組件 6.透過(guò)液流量計(jì) 7.調(diào)壓閥 8.濃縮液流量計(jì) 9.換熱器

黃芪多糖水提液由料液箱流入低壓泵，通過(guò)保安過(guò)濾器后，由高壓泵輸入到膜組件中，經(jīng)膜組件分離后，透過(guò)液通過(guò)膜組件上的透過(guò)液出口經(jīng)透過(guò)液流量計(jì)流出待用；濃縮液經(jīng)膜組件濃縮液出口經(jīng)過(guò)調(diào)壓閥、濃縮液流量計(jì)和換熱器后循環(huán)至料液箱。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，選擇循環(huán)或濃縮過(guò)程。用調(diào)節(jié)閥調(diào)節(jié)壓力。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取105℃干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖14 mg，置100 mL量瓶中，加適量水溶解，稀釋至刻度，搖勻，即得0.14 mg·mL-1對(duì)照品溶液。分別精密量取對(duì)照品溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL置具塞試管中，加水至2 mL;再精密加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻；迅速精密加入硫酸6 mL，搖勻，置40℃水浴10 min，取出；置冰水浴5 min，取出。以相應(yīng)的試劑為空白，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

擬合葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線得到線性回歸方程y=61.29x+0.0015，相關(guān)系數(shù)為0.9981。式中：y為吸光度；x為葡萄糖濃度(mg·mL-1)。

1.3.2 樣品測(cè)試

精密吸取待測(cè)樣品2 mL，按1.3.1方法測(cè)定吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算多糖含量。

1.3.3 分析方法

式中：ci為膜組件進(jìn)料中多糖濃度；cp為透過(guò)液中多糖濃度。

電導(dǎo)率采用DDS-307型電導(dǎo)率儀測(cè)定，濁度采用Hanna濁度分析儀測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 預(yù)處理

為了降低超濾對(duì)膜的污染、保證超濾膜的分離特性和通量、克服濃差極化，浸提液必須在超濾前進(jìn)行預(yù)處理，除去不溶性固形物。以固形物去除率及多糖損失為指標(biāo)對(duì)離心(3000 r·min-1)5 min、0.8 μm微濾以及5 μm精密過(guò)濾3種預(yù)處理方法進(jìn)行比較，結(jié)果見表1。

表1 3種預(yù)處理方法比較

由表1可見，3種預(yù)處理方法均可有效地去除粗多糖溶液中的雜質(zhì)。微濾預(yù)處理時(shí)，多糖損失高達(dá)66.0%，這可能是一些大分子量(大于200萬(wàn))[6，7]的黃芪多糖被微濾膜截留的緣故；5 μm精密過(guò)濾多糖損失最小，但不溶性固形物去除率稍差；高速離心對(duì)不溶性固形物有較高的去除率，多糖損失也較少。

預(yù)處理方式的選擇與后續(xù)超濾膜的選擇密不可分，若要最大限度保留所有多糖，則選擇精密過(guò)濾進(jìn)行預(yù)處理，同時(shí)，超濾選擇板式或管式；若要收集所要求的截留分子量的部分多糖，則選擇高速離心進(jìn)行預(yù)處理，同時(shí)，超濾選擇卷式或中空纖維。預(yù)處理方式的選擇較為靈活，應(yīng)根據(jù)料液性質(zhì)、富集多糖的范圍來(lái)定。

2.2 黃芪多糖分子量的分布

在35℃、0.3 MPa條件下選用截留分子量分別為400 kDa、200 kDa、10 kDa的濾膜對(duì)黃芪提取液依次進(jìn)行超濾，將多糖提取液分為4段，測(cè)定每段的多糖含量，結(jié)果見圖2。

圖2 黃芪多糖的分子量分布

由圖2可知，超濾后分子量>400 kDa的黃芪多糖約占總糖的40.6%，分子量在400～200 kDa之間的黃芪多糖占10.1%，分子量在200～10 kDa之間的黃芪多糖占33.5%，分子量<10 kDa的寡糖和單糖約占15.2%。

多糖的藥理活性與其初級(jí)結(jié)構(gòu)、高級(jí)結(jié)構(gòu)、分子量、溶解度、粘度有著密切的關(guān)系，多糖分子的多級(jí)結(jié)構(gòu)又與其分子量有著直接的關(guān)系，一般分子量為100～200 kDa的高分子多糖呈現(xiàn)較強(qiáng)的活性[8～10]，分子量為10～100 kDa的黃芪多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用[11～13]。因此，選擇分子量為10～200 kDa的黃芪多糖作為活性黃芪多糖制品進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 超濾工藝的優(yōu)化[14]

2.3.1 溫度對(duì)超濾的影響

唐亮（化名）自認(rèn)為是網(wǎng)絡(luò)游戲高手，但是自從在虛擬世界中遭遇另外一位游戲玩家“古世龍”后，就遭遇到了游戲的“滑鐵盧”?！肮攀例垺痹诰W(wǎng)絡(luò)中殺死了唐亮的朋友，搶了唐亮在游戲中的老婆，兩人在游戲中多次廝殺，唐亮總是失敗。終于，在網(wǎng)絡(luò)游戲中被殺死23次之后，分不清虛擬世界和真實(shí)世界的唐亮，決定采取一種特殊的報(bào)復(fù)方式，一場(chǎng)網(wǎng)絡(luò)游戲引起的血案就此發(fā)生。他叫上幾個(gè)平時(shí)一起玩網(wǎng)絡(luò)游戲的兄弟，找到現(xiàn)實(shí)當(dāng)中的“古世龍”，教訓(xùn)了他一頓。一場(chǎng)虛擬世界里的廝殺終于演變成了一場(chǎng)現(xiàn)實(shí)當(dāng)中的廝殺，二者最大的區(qū)別就是，在真實(shí)的世界里，人的生命只有一次。

在0.3 MPa壓力下，用截留分子量為10 kDa的濾膜對(duì)黃芪提取液進(jìn)行超濾，溫度對(duì)膜通量的影響如圖3所示。

圖3 溫度對(duì)膜通量的影響

由圖3可知，隨著溫度的升高，膜通量增大。這是因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)，升高溫度使溶液粘度下降、擴(kuò)散系數(shù)和傳質(zhì)系數(shù)增大、多糖溶解度增大，溶質(zhì)與水的親合力相應(yīng)增大，濃差極化相應(yīng)減小，導(dǎo)致膜通量增大；但溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致濾膜性能和溶液理化性質(zhì)的改變。綜合考慮，選擇超濾溫度為30℃。

2.3.2 壓力對(duì)超濾的影響

在 30℃對(duì)黃芪多糖提取液進(jìn)行超濾，壓力對(duì)膜通量的影響如圖4所示。

圖4 壓力對(duì)膜通量的影響

由圖4可知，隨著壓力的增大，膜通量顯著增大。這是因?yàn)閴毫Σ钶^小時(shí)，壓力的增大使溶液通過(guò)濾膜的推動(dòng)力增大，故膜通量明顯增大。當(dāng)壓力達(dá)到 0.35 MPa 后，膜通量趨于恒定；如再增加壓力，膜通量增加使得膜面上被截留溶質(zhì)的濃度增大，濃差極化作用加劇，開始形成較厚的膜面凝膠層，導(dǎo)致阻力大大增加，因而膜通量增加較少。綜合考慮，選擇超濾壓力為0.35 MPa。

2.3.3 流速對(duì)超濾的影響

在30℃、0.35 MPa條件下對(duì)黃芪多糖提取液進(jìn)行超濾，進(jìn)料流速對(duì)膜通量的影響見圖5。

圖5 流速對(duì)膜通量的影響

由圖5可知，隨著流速的不斷加快，膜通量呈上升趨勢(shì)。這是因?yàn)榧涌炝魉僮璧K了濃差極化的積累和形成，并且對(duì)膜面的沉積物也具有沖刷作用，從而減緩了膜面的污染。當(dāng)流速超過(guò)0.467 L·s-1時(shí)，膜通量反而下降。這是因?yàn)榱魉偌涌觳⒉荒軓母旧舷の廴?，過(guò)快的膜表面流速反而增大了壓力損失，作用在膜表面的有效壓力減小，膜通量也隨之減小。因此，選擇進(jìn)料流速為0.467 L·s-1。

2.3.4 初始料液濃度對(duì)超濾的影響

在30℃、0.35 MPa、0.467 L·s-1條件下，對(duì)黃芪多糖提取液進(jìn)行超濾，初始料液濃度對(duì)膜通量的影響見圖6。

圖6 初始料液濃度對(duì)膜通量的影響

由圖6可知，膜通量隨著初始料液濃度的增大而減小。這是因?yàn)?，一方面隨著初始料液濃度的增大，料液粘度增大，溶質(zhì)擴(kuò)散系數(shù)減小，由膜邊界向料液主體的反向擴(kuò)散通量減小，濃差極化嚴(yán)重；另一方面初始料液濃度增大，溶質(zhì)沉積在膜表面，阻塞膜孔，增加擴(kuò)散阻力，造成通量下降。由于初始料液濃度太低會(huì)增加濃縮的費(fèi)用，綜合考慮，選擇初始料液濃度為20 g·L-1。

2.4 黃芪多糖超濾產(chǎn)物

黃芪粗多糖水溶液采用5 μm精密過(guò)濾進(jìn)行預(yù)處理，處理液在初始料液濃度為20 g·L-1、溫度為30℃、壓力為0.35 MPa及進(jìn)料流速為0.467 L·s-1的條件下，用截留分子量為200 kDa和10 kDa的濾膜依次對(duì)料液進(jìn)行超濾，取分子量為100～200 kDa之間的濃縮液，進(jìn)行超濾得到活性黃芪多糖制品。制品中多糖含量由原來(lái)的36.0%提高到86.8%，說(shuō)明超濾是一種很有效的多糖純化方法。

2.5 超濾膜的清洗

在35℃、0.3 MPa下分別采用去離子水、氫氧化鈉溶液對(duì)污染后的超濾膜(以10 kDa為例)進(jìn)行清洗，結(jié)果見表2。

表2 超濾膜的清洗效果對(duì)比

由表2可知，超濾膜經(jīng)去離子水清洗后，膜通量恢復(fù)較差，只有31.5%；采用氫氧化鈉溶液清洗后，膜通量恢復(fù)率達(dá)到84.7%。

3 結(jié)論

采用截留分子量為200 kDa和10 kDa的超濾膜對(duì)黃芪多糖進(jìn)行提取分離，在初始料液濃度為20 g·L-1、壓力為0.35 MPa、溫度為35℃、進(jìn)料流速為0.467 L·s-1的最佳條件下，多糖含量由36.0%提高到86.8%。有效實(shí)現(xiàn)了黃芪多糖提取液中活性多糖與大分子蛋白、多酚等物質(zhì)的分離。

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