腸球菌為主要菌群的腹瀉標本的16S rRNA與PFGE分析*

周永運,許彥梅,崔志剛,金 東,趙愛蘭,葉長蕓,徐建國

腸球菌是院內常見條件致病菌,腹瀉標本有時也可分離到該菌,經常被認為是菌群失調的結果。為了解該類標本分離腸球菌菌株的克隆特征,進行了16S rRNA和PFGE方法以進一步分析。

1 材料及方法

1.1 樣本特征及來源 與山西省臨床檢驗中心合作,從太原市某醫院采集兒童腹瀉糞便標本,其中4例腹瀉病患者的標本初步培養以腸球菌為優勢菌群,腹瀉兒童的病歷材料見表1。

1.2 菌株來源及分離培養 所分析菌株包括以上4份腹瀉病人糞便標本在厭氧和CO2環境中分離的各50株左右屎腸球菌和個別糞腸球菌;4個健康兒童糞便標本厭氧和CO2環境中分離的各10株腸球菌。取0.01mL糞便懸液,均勻涂布整個血平皿。在厭氧和 5%CO2兩種條件下,用厭氧血平皿置37℃溫箱培養24h,接種腸球菌的選擇性培養基(含七葉苷的腦心培養基礎),每份標本逐個挑選50個黑色菌落左右。

1.3 主要試劑 AmpliTaq Gold DNA聚合酶購自ABI公司;dNTP購于Promega公司;Sma I酶和DNA分子量marker購自Takara公司;DNA回收試劑盒Qiaquick?Gel Extraction kit購自Qiagen公司的;細菌基因組DNA提取試劑盒購自Promega公司;觸酶、氧化酶購自梅里埃公司;溶菌酶購自Invitrogen公司。

表1 4個腹瀉兒童的病歷材料Table 1 Medical record of 4 diarrhea children

1.4 主要儀器和設備 PCR儀為MG公司的PTC-200;凝膠成像系統為Bio-Rad公司Gel Doc XR型凝膠成像儀;細胞培養箱為Thermo forma;厭氧培養罐購自Oxoid公司;生化鑒定儀為DATE BEHRING公司Microscan WalkAway40 S1;PFGE為Bio-Rad公司 CHIF-Mappper脈沖場凝膠電泳儀。

1.5 16S rRNA基因序列分析方法

1.5.1 臨床標本的采集和處理 無菌采集腹瀉病人的糞便標本、稱重,加10倍體積磷酸鹽緩沖液(0.02mol/L)重懸。4℃,12 000r/min離心 2min,棄上清。然后加等體積的磷酸鹽緩沖液重懸離心后得到的細胞沉淀可立即進行DNA提取或置-70℃冰箱冷凍保存。

1.5.2 總DNA的提取 標本中總DNA的提取參照已有的方法〔1〕。

1.5.3 16S rRNA基因保守區的擴增 使用16S rRNA通用引物〔2,3〕u9:5′-agagtttgatcytggyty ag-3′,907r:5'-ccgtcaattcmtttragttt-3'對標 本 中 總DNA進行擴增:反應體系為20μL,包括 10×buffer 2μL,2.5mmol/L MgCl2 2μ l,dNTP 1.6μL,上引物0.5μL,下引物 0.5μL,Gold 酶 0.2μL(1U),DNA模板 1μL,BSA(1mg/mL)2μL,三蒸水 10.2μL。擴增條件:預變性 95℃12min,后續 95℃50s,52℃30s,72℃1min30s,20個循環,72℃延伸10min。

1.5.4 PCR產物的回收及與載體的連接、轉化和克隆子的篩選 PCR產物的純化、回收按照試劑操作手冊進行。純化產物與T載體連接,以CaCl2法轉化感受態細胞DH5α,進行藍白斑篩選,每份樣本選擇約80個克隆子分別送上海生工生物工程公司、北京華大基因測序有限公司、北京擎科生物公司進行平行3次測序。測序儀為ABI公司的3730型生物測序儀。

1.5.5 序列的比對與統計分析 測得的序列首先使用Chromas軟件觀察測序質量,以CATGCAA作為起始序列,CCGGCTAA作為終止序列進行序列截取,將截取的序列用軟件blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast)在 NCBI和本室建立的核糖體共有序列數據庫(www.RCSD.com)進行比對,比對的結果根據序列的相似性程度百分比進行分類統計分析。

1.6 PFGE 每份腹瀉標本隨機選擇20株屎腸球菌,正常標本Y隨機選擇10株屎腸球菌進行PFGE分析。PFGE方法參照美國CDC李斯特菌的標準操作略有改動〔4〕。從血平皿上沾取適量細菌,均勻懸濁于TE中,用 BioMerieux Vitek colorimeter測其OD值并調整至6.1～6.3。取240μL細菌懸濁液于相應的 1.5mL Eppendorf管中,加入 60μL溶菌酶溶液,置于37℃水浴中孵育10min。配制細胞裂解液(CLB)時每5mL細胞裂解液加入37.5μL蛋白酶K,然后顛倒混勻。選用 SmaI(50U)酶切,37℃水浴中孵育至少2h。電泳預設溫度在14℃,電泳參數為:初始脈沖時間2s;終止脈沖時間18s,電泳時間18h。圖象用Gel Doc DR采集,采用Bionumarix軟件分析。

2 結 果

2.1 4位腹瀉患者糞便標本的16S rRNA基因序列分析 本研究檢測了4份患兒糞便標本,每份標本檢測3次。2號患兒標本總共檢出6個種菌屬,以 Enterococcus f aecium、Streptococcus sanguis為主,分別占總克隆量的68.6%(208/303)和25.1%(76/303),3次實驗均有檢出;另外 Rothia mucilaginosa也是3次實驗均有檢出,但數量較少,小于克隆量的 5%(13/303),Escherichia.coli、Actinomycesodontolyticus、Granulicatella三個菌屬在不同的實驗中有檢出,小于總克隆的2%(3/303,3/303,1/303)。

3號患兒標本總共檢出4個種屬,含量較多的Enterococcus f aecium和Bacteroides sp 3次實驗均有檢出,分別占85.3%(250/293)和13.7%(40/13.7);Rothia mucilaginosa、Actinomyces odontolyticus數量較少,小于克隆量的 2%(2/293,1/293)。

6號患兒標本總共檢出4個種屬,含量較多的Enterococcus faecium、Streptococcus sp,3次實驗均有檢出,分別占總克隆的 95.9%(231/241)和2.1%(5/241);Rothia mucilaginosa、Escherichia.coli數量較少,小于克隆量的2%(3/241,2/241)。

8號標本的結果見表5。8號標本總共檢出6個種屬,含量較多的Enterococcus f aecium、Rothia mucilaginosa、Escherichia coli、Enterococcus f aecalis 3次實驗均有檢出,分別占總克隆的 91.1%(246/270)、2.2%(6/270)、3.0%(8/270)和 2.6%(7/270);Ochrobactrum lupini、Actinomyces odontolyticus數量較少,小于克隆量的2%(2/270,1/270)。

2.2 腹瀉標本與正常標本的屎腸球菌分離菌株的PFGE圖譜比對 分離健康兒童糞便標本:2個不滿周歲的兒童糞便(X,Z),1個5歲兒童的糞便(Y),1個8歲兒童的糞便(K)。用選擇性培養基結晶紫膽鹽七葉苷篩選,每份在厭氧和CO2培養條件下共隨機挑選10個菌。

腹瀉患兒屎腸球菌分離菌株的染色體經過Sma I酶切后的PFGE圖譜見圖1。PFGE結果顯示,2、3、6號標本中以一種 PFGE帶型為主,在20個菌株的PFGE帶型中均僅有一個不同帶型,分別為2.36C、3.79C、6.2N,8號標本中存在5個帶型,每個帶型在 20個菌株中分別有:9、5、3、2、1個菌。Bionumerics軟件的聚類結果與正常健康兒童糞便標本照的對PFGE結果一起顯示,見圖1。

圖1 腹瀉標本與正常對照標本屎腸球菌的PFGE聚類分析結果Fig.1 PFGE dendrogram showing clustering of PFGE types recovered from diarrhea and normal specimens

3 討 論

進行腸道微生態分析,使用傳統方法進行病原菌的分離和鑒定,需要獲得純的培養物,但是能夠獲得純培養的細菌比例少,還有大量的細菌不能得到培養和鑒定。僅僅依靠傳統方法難以進行菌群分析,目前認為,以16S rRNA基因序列分析結合表型分析的鑒定方法,是細菌學檢測和鑒定的發展方向〔5〕。PFGE是屎腸球菌流行病分型的可選方法,較其他方法分辨力更高,所有的菌株可以分型并且重復性好〔6〕。

本研究利用培養和16S rRNA序列分析方法發現,4個腹瀉標本分離到的菌株均以屎腸球菌為主,而4個正常的健康兒童的糞便標本中僅Y一個以屎腸球菌為主。腹瀉兒童的16S rRNA菌群分析顯示菌群比例嚴重失調,常駐菌大大減少而腸球菌比例上升至68%以上,本結論與國外學者用DGGE電泳調查腹瀉病人和無癥狀的人群的糞便菌群構成發現腹瀉標本更多表現出細菌種類減少和某種細菌的過度生長的現象一致〔7〕。在荷蘭調查的所有624位住院病人和200位住社區中病人的糞便標本中,屎腸球菌的分離率分別為43%和32%,明顯低于本研究具有腹瀉特征標本的分離率和百分比〔8〕。

利用SmaI酶切后進行PFGE電泳,聚類分析后發現腹瀉標本中的除8號腹瀉標本含有5個PFGE聚類克隆外,屎腸球菌中 2、3、6 PFGE聚類單一,表現為克隆性聚類克隆。正常的健康兒童Y標本,表現為屎腸球菌非克隆性,含有4種PFGE聚類克隆;其他健康兒童含有糞腸球菌或多種腸球菌,種類更加多樣。

腸球菌是社區感染和院內感染的主要病原菌,可引發心內膜炎,菌血癥,尿路感染,新生兒感染,中樞神經,腹腔和盆腔感染等〔9〕。美國國家醫院感染監測系統(National Nosocomial Infections Surveillance,NISS)已將其列為醫院感染的第2位病原菌〔10〕。但是國外尚無腸球菌引起腹瀉的臨床報道和流行病學資料。在我國部分省市陸續有腸球菌引發食物中毒的報道。2001年8月廣東省東莞市常平鎮某公司食堂發生了一起集體食物中毒,實驗室證實為一起糞腸球菌引起的食物中毒〔11〕。本實驗采用16S rRNA基因序列分析發現,腸球菌是優勢菌群(＞68%),次要菌群包括羅氏菌,鏈球菌,大腸桿菌,放線菌。這4份標本的菌群構成非常相似,沒有發現其他可疑腹瀉細菌。從臨床治療的效果來看,應用針對腸球菌敏感的抗生素后加上補液等輔助治療后患兒痊愈,提示腸球菌可能與腹瀉有著密切關系。

本研究從16S rRNA和PFGE的角度對腹瀉糞便標本進行了分析,得到腹瀉兒童腸球菌分布的初步規律,其致病性和相關機理還待今后實驗范圍的進一步擴大和研究的深入。

〔1〕麗鴻,趙勇,陳明杰,等.堆肥中微生物總DNA的高效提取〔J〕.微生物學報,2006,46:162-165.

〔2〕M cInnery JO,Wilkinson M,Patching JW,et al.Recovery and phylogenetic analy sis of novel archaeal rRNA sequences from deep-sea deposit feeder〔J〕.Appl Environ Microbiol,1995,61:1646-1648.

〔3〕Watanabe K,Kodama Y,Harayama S.Design and evaluation of PCR primers to amplify 16S ribosomal DNA fragments used for community fingerprinting〔J〕.J Microbiol Methods,2001,44:253-262.

〔4〕http://www.cdc.gov/PULSENET/protocols.htm.

〔5〕Weisburg WG,Barns SM,Pelletier DA,et al.16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study〔J〕.J Bacteriol,1991,173:697-703.

〔6〕Werner G,Klare I,Witte W.T he current MLVA typing scheme for Enterococcus f aecium is less discriminatory than M LST and PFGE for epidemic-virulent,hospital-adapted clonal types〔J〕.BMC Microbiol,2007,7:28.

〔7〕Mai V,Braden CR,Heckendorf J,et al.Monitoring of Stool Microbiota in subjects with diarrhea indicates distortions in composition〔J〕.J Clin Microbiol,2006,44(12):4550-4552.

〔8〕Endtz HP,van den Braak N,van Belkum A,et al.Fecal carriage of vancomycin-resistant enterococci in hospitalized patients and those living in the community in The Netherlands〔J〕.J Clin Microbiol,1997,35(12):3026-31.

〔9〕Murray BE.The life and times of the Enterococcus〔J〕.Clin MicrMicrobiol Rev,1990,3:46-65.

〔10〕Richards MJ,Edwards J R,Culver DH,et al.Nosocomial infections in combined medical2surgical intensive care units in the United States〔J〕.Infect Control Hosp Epidemiol,2000,21(8):510-515.

〔11〕單金華,袁欽華.一起糞腸球菌食物中毒的調查〔J〕.實用預防醫學,2001,8:394.